酿酒酵母联产生物质基异戊二烯-乙醇的基础研究

A key issue in large-scale production of biomass-based bulk chemicals is how to elevate the utilization efficiency of the carbon source. In order to improve the economical efficiency of isoprene biosynthesis from biomass using Saccharomyces cerevisiae, solutions are to be found for the difficulty in pentose utilization and the relatively low theoretical yield from glucose to isoprene. To this end, this proposal plans to integrate methods of metabolic engineering and process engineering. First, the sugar metabolism and transportation in S. cerevisiae is systematically engineered to facilitate simultaneous efficient conversion of glucose and xylose. Then, the complete metabolic pathway from biomass to isoprene is constructed by incorporating the previously optimized isoprene biosynthetic pathway. Finally, the fermentation conditions are regulated to realize “distillation tower-like” multi-component bioproduction, in which the gaseous product isoprene is synthesized under aerobic condition, the liquid product ethanol is produced using residual sugar under anaerobic condition, and the yeast cells are recovered as the solid product. In this way, the carbon utilization efficiency of biomass would be largely improved. This work will provide a new route to the eco-efficient manufacturing of biomass-based bulk chemicals, and is therefore of research and application significance.

如何提高碳源的利用效率是利用生物质经济地制备大宗化学品所需要解决的关键问题之一。为了提高酿酒酵母转化生物质原料生物合成异戊二烯的经济性，必须要解决生物质中五碳糖难以转化以及葡萄糖到异戊二烯理论产率低等难题。本项目计划结合代谢工程与过程工程的技术手段，首先对酿酒酵母的糖代谢和转运途径进行改造，使之能够同时高效转化葡萄糖和木糖，然后结合前期构建的异戊二烯合成强化途径，建立完整的从生物质生产异戊二烯的代谢通路，最后通过发酵过程的合理控制实现好氧条件下产异戊二烯（气）、厌氧条件下利用残糖产乙醇（液）、酿酒酵母菌渣作为潜在的动物饲料（固）的分阶段多组分产出的“蒸馏塔式”生物合成新工艺，以此提高碳源的利用效率。该项研究将为经济地制备生物质基大宗化学品开拓新的思路，同时具有良好的理论意义和应用价值。

如何提高碳源的利用效率是利用生物质经济地制备大宗化学品所需要解决的关键问题之一。异戊二烯是合成橡胶的重要单体，同时也是医药、香料和农药等领域的重要原料，其生物法合成具有环境友好、条件温和、原料可再生等优势。为了提高酿酒酵母转化生物质原料生物合成异戊二烯的经济性，本项目围绕在酿酒酵母中构建高效木糖代谢途径以利用廉价碳源和提高异戊二烯合成的碳利用率开展研究。一方面对酿酒酵母的糖代谢和转运途径进行改造，使之能够利用葡萄糖和木糖，另一方面对异戊二烯生物合成途径进行强化和代谢调控，提高异戊二烯的生物合成效率，从而提高碳源利用效率。.首先，构建了基于tRNA 加工的CRISPR/Cas9工具盒，用于酿酒酵母的多位点编辑。然后，利用这套工具，引入了外源木糖异构酶构建木糖代谢途径，并在此基础上通过敲除木糖还原酶基因gre3和磷酸酶基因pho13以及过表达木酮糖激酶TAL1，提高了其木糖利用效率，并建立了木糖转运蛋白的分子改造方法，最终构建了利用木糖产异戊二烯的酿酒酵母重组菌株。.同时，为了提高酿酒酵母合成异戊二烯的效率，对甲羟戊酸途径的重要前体物丙酮酸在线粒体和细胞质中的合理分配进行了研究，并初步探讨了异戊二烯合成的乙醇响应调控。最终，完全敲除丙酮酸线粒体转运蛋白MPC3的线粒体/细胞质双调控菌株YXMH32-KOM-ISPSLN在补料发酵中异戊二烯产量可达14.3g/L，这是目前报道的真核生物中最高的产量。.为了缓解细胞生长与异戊二烯合成之间的矛盾，通过定向进化获得了具有冷敏表型的Gal4突变体，并利用热激启动子控制该突变体的表达，实现了异戊二烯合成途径的双重温度调控。研究结果表明，温度调控确实能够改善工程酵母细胞的生长状况，并有利于异戊二烯的合成。.总的来说，本项目构建了能够利用木糖产异戊二烯的酿酒酵母工程菌株，建立了异戊二烯合成的双重温度调控策略，优化了线粒体和细胞质中的前体物分配，提高了酿酒酵母的异戊二烯合成效率，为利用生物质原料生产异戊二烯奠定了初步的研究基础，并且为其他天然产物的异源合成及其调控提供了借鉴。