新的潜在癌基因NOVA1在肝癌中的表达及其功能研究

寻找肿瘤新的相关基因和治疗分子靶点是肿瘤研究领域的一个热点。拷贝数变异（CNV）是最近才受到广泛关注的一类遗传变异，被发现与多种疾病发生相关包括肿瘤。课题组前期应用美国Affymetrix 公司500K高通量基因芯片，对肝癌患者的全基因进行了扫描，发现在14q12有一CNV片段在肝癌病例中明显增加(OR>5)，扩大样本和实时PCR重复验证证实肝癌患者存在此段拷贝数变异,并发现此CNV片段相关基因NOVA1在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织。本课题拟在上述研究的基础上，通过对临床肝癌组织标本中NOVA1基因的表达研究，分析其和肝癌发生、发展以及与预后的关系；同时通过肝癌细胞株研究NOVA1基因过表达和抑制表达后其生物学特征的改变（细胞增殖和凋亡，克隆形成、迁移和裸鼠体内成瘤等）。希望能明确NOVA1基因在肝癌发生、发展中的临床意义和潜在功能，初步证明NOVA1基因是肝癌发生相关的新的易感基因。

肿瘤神经腹侧抗原-1 (Neuro-oncological ventral antigen-1，Nova1) 基因是一种中枢神经系统特异性的RNA结合蛋白。其作为一种神经系统的自身抗原，首先在副肿瘤性斜视眼阵挛-肌阵挛共济失调患者中被发现。一些研究已经发现Nova1在恶性肿瘤细胞中有表达。但至今未有研究报道关于Nova1在肝细胞肝癌中的表达。本研究分三部分探讨了Nova1在人肝癌组织中的表达情况及同时通过各种体内体外实验了解Nova1基因在肝癌发生、发展中的临床意义和潜在作用机制，初步证明了Nova1基因是肝癌发生相关的新的易感基因。1.Nova1在人肝癌组织中的表达及与患者临床病理特征的关系：我们采用免疫组化法检测了Nova1在91例肝癌组织和配对癌旁组织中的表达，同时我们随机选取了四对肝癌和癌旁组织，提取组织蛋白后通过免疫印迹法检测Nova1蛋白表达量。免疫组化及免疫印迹法均提示Nova1在肝癌组织中的表达水平高于配对癌旁组织。进一步结合临床随访资料后发现肝癌组织Nova1阳性表达是影响总生存率 、至复发生存率 、早期复发的独立危险因素。Kaplan-Meier生存曲线显示，癌内高表达Nova1的患者OS和TTR要显著低于低表达组。而癌旁Nova1高表达患者OS和TTR与低表达患者相比无明显差异。这一部分研究提示，Nova1可能与HCC患者预后相关，在HCC的转移复发中起一定作用。2.Nova1诱导型表达载体的构建及体外对肝癌细胞生物学行为的影响：我们进一步构建和验证了Nova1干扰和过表达的诱导型载体的单克隆细胞株。诱导型表达载体是通过强力霉素来诱导基因的过表达和下调。随后通过一系列体外细胞功能实验，进一步证实了与对照组相比，Nova1下调后，其肝癌细胞的迁移和侵袭能力能明显减弱；另一组，过表达Nova1后细胞增殖和迁移能力相比于对照组明显增强。提示Nova1可能是通过调控肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，从而促进了肝癌细胞的增殖及术后的复发。3. 体内Nova1对肝癌细胞生物学行为的影响及其促进肝癌发展的潜在机制探讨：我们首先行裸鼠体内皮下成瘤实验。实验结果提示，Nova1过表达对肝癌肿瘤具有促进生长的作用，而相反下调Nova1能够抑制肝癌肿瘤生长。进一步查阅相关文献，我们选择Nova1参与的可变剪接GABAA受体γ2(GABAARγ2) 进行深入研究。免疫组