EMAP-II通过miR-330调控PKC亚型开放血肿瘤屏障、抑制胶质瘤增殖的机制与应用

我们前期研究发现EMAP-Ⅱ既能选择性开放血肿瘤屏障(BTB)，又能促进脑胶质瘤干细胞(CSCs)和血管内皮细胞凋亡。为深入研究EMAP-Ⅱ的作用机制，本项目首先研究PKC是否通过直接磷酸化紧密连接相关蛋白和/或通过Rho/ROCK信号途径间接调节紧密连接功能，明确EMAP-Ⅱ开放紧密连接的机制；同时探讨PKC(α,β,ζ)是否通过死亡受体信号途径促进CSCs和血管内皮细胞凋亡；进一步分析miR-330与PKC(α,β,ζ)基因的直接作用和关键结合位点，研究miR-330对PKC (α,β,ζ)基因表达和功能调节的机制；最后明确EMAP-Ⅱ、Ad-siRNA-miR-330和Ad-PKC(α,β,ζ)单独或联合应用增加BTB通透性和抑制肿瘤的最佳方式，联合应用化疗药物观察对裸鼠脑胶质瘤的抑瘤效应。本研究不仅能明确EMAP-Ⅱ开放BTB和抑瘤效应的机制，而且能为胶质瘤治疗提供新途径。

本项目研究结果显示，EMAP-II作用后能够显著上调体外BTB模型中PKCα、PKCβ、和PKCζ亚型的表达和活性，应用抑制剂或构建shRNA重组载体使内皮细胞中PKCα、PKCβ、和PKCζ沉默后，EMAP-II增加BTB模型通透性、下调紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5蛋白表达的作用显著减弱。进一步证明EMAP-II能够通过Rho/ROCK信号通路增强PKCα和PKCβ的活性，进而增加BTB的通透性。EMAP-II通过增加胶质瘤干细胞(GSCs)的中PKCα、PKCβ和PKCζ的表达和活性，抑制细胞活性；阻断PKCα、PKCβ和PKCζ的作用后，胶质瘤干细胞的细胞活力显著增加；在内皮细胞上获得了相似的结果。上述结果证明EMAP-II通过激活PKC抑制GSCs和内皮细胞的细胞活力。EMAP-II作用后miR-330的表达显著下调；miR-330过表达能够显著降低体外BTB模型的通透性，上调ZO-1 、occludin和claudin-5的蛋白表达水平；miR-330表达沉默的作用与之相反；证明EMAP-II通过抑制miR-330下调紧密连接相关蛋白的表达，增加体外BTB模型的通透性。此外，miR-330过表达能够增强胶质瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭能力；增强内皮细胞的细胞活力；miR-330表达沉默的作用与之相反；证明EMAP-II通过下调miR-330的表达抑制胶质瘤干细胞和内皮细胞的生长。PKC(α、β和ζ)-3’UTR存在miR-330的作用靶点，miR-330对PKC(α、β和ζ)基因的表达起到负性转录后调节作用；miR-330通过靶向调控PKC(α、β和ζ)的表达，发挥增加BTB通透性和抑制肿瘤增殖的作用。在裸鼠脑胶质瘤模型上证明，EMAP-II、Ad-siRNA-miR-330和Ad-PKC(α、β和ζ)单独或联合应用能够有效增加BTB通透性，促进化疗药物卡铂转运，显著抑制裸鼠脑胶质瘤的生长，EMAP-II、Ad-siRNA-miR-330和Ad-PKCα三者联合应用效果最显著。