内源性危险信号ADP及其受体在病毒感染中的功能和机制研究

Extracellular nucleotides as a kind of danger signals play crucial roles in cell damage, inflammation and tumor formation. But until now, the function and mechanism of extracellular nucleotides in viral infection has not been well demonstrated. Our preliminary data showed that ADP was released obviously by virus infected cells. Meanwhile, the expression of ADP’s receptors as interferon stimulated genes were increased obviously in viral infection. Especially, the infection efficiency and virus induced cell damage were also reduced significantly in ADP treated cells and mice, which suggested the key role of ADP in viral infection. So, we propose to systematically investigate the pattern of ADP release in virus infection through chemoluminescence assay. Meanwhile, we will use different channel inhibitors to explore the mechanism of virus inducing ADP release. Then we will further investigate the pivotal roles of ADP in viral infection both in vivo and in vitro. Furthermore, we will seek key molecules and signaling pathway involved in ADP mediated immune regulation through gene chips, qRT-PCR, ELISA and immunofluorescence. Finally, we will further explore the molecular mechanisms of ADP regulated anti-viral immune responses in signal transduction, genetic transcription and gene knockout mouse model, which will lay a theoretical foundation for discovering novel anti-viral drugs based on purinergic signaling.

胞外核苷酸作为细胞分泌的危险信号分子，在细胞损伤、炎症以及癌症发生中发挥了重要作用，但关于其在病毒感染中的功能和机制还有待阐明。本课题前期研究发现：病毒感染时大量ADP被释放到胞外，其特异性嘌呤受体P2Y12及P2Y13的表达显著上升，具有典型的干扰素诱导基因特征。且ADP能显著降低病毒对细胞和小鼠的感染和损伤，提示我们ADP在病毒感染中的重要作用。因此，本课题拟首先采用化学发光技术系统分析ADP在病毒感染中的释放规律，利用通道抑制剂探讨ADP的释放机制，然后从动物、细胞和分子水平阐明胞外ADP释放及其受体表达在病毒感染中的生理、病理意义。最终利用表达谱芯片、荧光定量PCR、ELISA以及免疫荧光等技术寻找ADP及其受体调控抗病毒免疫的核心分子和关键途径，并从信号转导、基因转录以及基因敲除动物整体水平研究ADP抗病毒的分子机制，为基于胞外核苷酸及其受体的抗病毒药物开发奠定理论基础。

病毒感染后，宿主启动一系列信号级联反应，以诱导I型干扰素的产生，从而诱导ISG排除入侵病毒。作为ADP的膜受体，P2Y12和P2Y13都可以通过抑制ADCY的活性并减少cAMP的产生。项目中我们证明P2Y13被I型干扰素上调，其内源性配体ADP作为危险信号从病毒感染的细胞中释放出来，细胞外ADP激活的P2Y13以cAMP依赖性方式保护宿主抵抗病毒感染。我们的项目揭示了ADP/P2Y13在对抗病毒感染中的重要作用，这表明嘌呤能受体作为新型抗病毒靶标的潜在应用前景。我们发现cAMP可挽救ADP抑制的VSV复制和细胞杀伤作用。此外，类似于ADP，ADCY抑制剂KH7也抑制VSV复制，表明cAMP在ADP/P2Y13介导的抗病毒活性中起关键作用。作为第一个确定的第二信使，cAMP在微生物发病机理中起着至关重要的作用。PKA和EPAC是细胞内cAMP的两个经典传感器，对于许多生物过程都是必不可少的。EPAC具有两种同工型，即EPAC1和EPAC2。cAMP/EPAC信号通路对于控制各种细胞功能（包括细胞粘附，胞吐作用和微管动力学）非常重要。先前的研究报告称，EPAC1是治疗致命性rickett-sioses的潜在靶标，而EPAC1基因表达的沉默使细胞对MERS-CoV感染具有抵抗力。在我们的研究中，我们发现PKA和EPAC抑制剂均抑制病毒复制。但是，只有EPAC抑制作用才能阻断ADP/P2Y13介导的抗病毒活性。此外，我们发现EPAC2抑制剂不能阻断ADP/P2Y13介导的抗病毒活性。这些发现表明，ADP/P2Y13介导的抗病毒活性主要取决于EPAC1。在HeLa细胞中敲除EPAC1表现出相似的结果，并进一步证明了这一点。我们的结果表明，病毒感染后，病毒可以触发细胞内cAMP水平的上调以激活EPAC1，从而促进病毒复制。但是，该病毒还会触发从这些细胞释放的ADP，从而激活P2Y13并抑制cAMP/EPAC1信号通路来抑制病毒复制。这种现象表明病毒感染期间动物体内的负反馈调节，并且P2Y13的激活和cAMP/EPAC1信号通路的抑制是潜在的抗病毒策略。