利用仿生胶束靶向多种toll样受体的肿瘤多肽疫苗的研究

Peptide-based tumor vaccine is generally recognized as one of the greatest potential approaches for personalized immunotherapy. However, their insufficient immunogenicity limits their clinical use. By mimicking live attenuated virus particles, combination of multiple TLR agonists was reported previously to synergy immune response. In our previous study, mixed micelles with a small size that consisted of PEI-SA (polyethyleneimine-stearic acid, PSA) and DSPE-PEG remarkably promoted the draining of Trp2 antigen peptide and CpG ODN into lymph node and showed strong anti-tumor immune response in a therapeutic mouse model. In order to enhance the safety profile of the mixed micelles and further augment the anti-tumor immune response, we design a novel mixed micelle-based tumor vaccine by replacing PEI-SA with amphiphilic antigen peptide for co-delivering human tumor antigen and multiple TLR agonists. The anti-tumor efficacy of the biomimetic micelle-based tumor vaccine will be tested in the prophylactic and therapeutic anti-tumor mouse models, respectively. And further we will investigate how these TLRas (different type, dose or combination) shape the anti-tumor immune response. This project will be beneficial to direct rational design of peptide-based tumor vaccine.

肿瘤多肽疫苗是极具前景的免疫治疗手段之一。然而由于抗原多肽的免疫原性弱，CD8+ T细胞免疫应答不足而使其临床效果差。近年来研究报道，减毒病毒因含多种Toll样受体 (Toll-like receptor, TLR) 激动剂，可调控多种TLR信号通路而放大免疫应答。我们前期研究发现，由两亲性的聚乙烯亚胺-硬脂酸（PSA）和DSPE-PEG组成的混合胶束可促进抗原肽和TLR9激动剂 (TLR9a) 在淋巴结的分布和CD8+ T细胞免疫应答。为进一步提高该疫苗递送系统的安全性和有效性，本项目拟用两亲性的肿瘤抗原肽取代PSA；同时模拟病毒的结构和功能，通过分子间的相互作用力引入TLR2a、TLR3a和TLR9a而构建一种仿生纳米胶束。我们将在体外和体内水平考察其免疫疗效；并进一步阐明所用TLRa的种类，组合和剂量对免疫应答的调节和作用机制。本项目的实施对肿瘤多肽疫苗的理性设计具有重要的指导意义。

多种Toll样受体(（TLRs）激动剂联用有望克服由一种TLR激动剂（TLRa）反复刺激或高剂量刺激所致的免疫耐受，从而增强TLRas在肿瘤免疫治疗中的应用潜力。本项目实施中，我们首先比较了巨噬细胞Raw264.7对游离TLR2激动剂Pam3csk4,TLR3 激动剂PolyIC和TLR9激动剂CpG单一组分，两组分或者三组分的应答能力。结果发现 Pam3csk4,PolyIC或CpG皆可启动免疫刺激因子IL-6和免疫抑制因子IL-10的产生，且单组分剂量的升高对IL-6和IL-10的产生影响不大。但是两组分和三组分混合可以显著增强细胞因子的表达，其中Pam3csk4和polyIC的组合诱导的IL-6和IL-10最高，且细胞因子的水平随着剂量的增加而明显增加，CpG加入后，炎症表达减弱。在动物水平上，以鸡卵清蛋白（OVA）为模型抗原，我们比较了含一种或者多种TLRas作为免疫佐剂诱导特异性体液免疫和细胞免疫的能力。通过elisa分析血清中IgG和其亚型的滴度，通过CD8+/OVA-Tetramer抗体检测血液中特异性CD8+ T细胞。结果发现含2种或者3种TLRas联用比单一TLRa刺激诱导了更高水平OVA特异性的IgG和CD8+ T细胞。其中，混合组之间，TLR2a/3a和三组分混合诱导的IgG2a水平较好，而三组分联合诱导了更高水平的CD8+ T细胞应答。 进一步地，我们以薄膜法和静电吸附的方式制备了含一种或者多种TLRas和黑色素瘤抗原肽Trp2的胶束，并对其进行了理化表征和初步的体内评价。此外，为突破脂多糖（LPS）介导的免疫耐受，我们加入了羟基磷灰石纳米粒（HANPs），结果发现，HANPs可以诱导巨噬细胞上TLR4的内吞，以及下游信号NF-κB 和IRF3 信号通路的活化。且HANPs协同LPS促进了TLR4信号通路的活化。在体内外内毒素耐受模型中，HANPs突破了内毒素耐受，增强了细胞对LPS重复刺激的敏感性。因此，本项目证实了混合多种TLR激动剂可实现增强体外天然免疫应答和体内特异性免疫的目的。同时制备了包裹多种TLRas的仿病毒结构和功能的纳米胶束疫苗，我们将进一步探索其抗肿瘤免疫治疗效果。此外，羟基磷灰石纳米粒也可作为突破TLR激动剂诱导的免疫耐受的一种强有力的工具。本项目为TLRa作为疫苗佐剂的理性选择和设计提供依据。