单核苷酸分辨率全基因组R-loop检测方法研究

The R-loop is a special chromosome structure, which containing a DNA-RNA hybrid and another unpaired single-stranded DNA, playing important roles in multiple biological processes. For now, many genome-wide R-loop profiling methods are developed, which strongly promote the researches on R-loops. However, there are some disadvantages of these methods. First, the R-loop mapping resolution is not high enough, not single-nucleotide resolution; second, these methods need plenty of biological materials, which limits the application range; third, these methods cannot quantify R-loops. To address these questions, based on ssDRIP-seq method we developed previously, we will improve the R-loop profiling method in three ways: modify the genomic DNA extraction, use single-stranded DNA nuclease to apart DNA-RNA hybrids, use artificial R-loops as “spike-in”. These modifications will make the new method efficient, single-nucleotide resolution and quantified. Based on this new method, the R-loops in different tissues of Arabidopsis during different developmental stages will be profiled and analyzed, which will help us understanding the different origins and functions of R-loops, and introduce new insight of plant R-loops.

R-loop是一种特殊的核酸结构，由一条DNA-RNA杂合链以及另一条未配对的单链DNA所组成，在多种生物学过程中发挥重要功能。目前已有多种全基因组R-loop测序技术被开发出来，极大地促进了R-loop研究工作。然而这些技术尚存在一些不足，包括：R-loop定位精度不佳，尚无法达到单核苷酸分辨率；所需样本量较大，无法研究微量样本；缺乏定量能力。申请人在过去的研究工作中成功开发了一种高效的R-loop测序技术，ssDRIP-seq。申请人将在此基础上，通过改进基因组DNA提取方法，引入单链核酸内切酶体系以及外源“spike-in”技术，完善R-loop测序技术，以达到低样本量需求、单核苷酸分辨率、相对定量这三个标准。基于这项新技术，申请人将绘制拟南芥发育过程中各个组织的R-loop精细图谱，并通过数据分析揭示拟南芥R-loop的不同起源，为植物R-loop研究提供新的视角。

R-loop是一种特殊的染色质结构，其由一条DNA-RNA杂合链与另一条自由DNA单链所构成。R-loop广泛存在于从原核生物到高等动植物的各种生物基因组中，并执行多种功能。R-loop可以导致基因组不稳定性上升，也参与DNA修复过程，同时也对基因组结构及基因表达起重要调控作用。因此，需要开发准确、高效、适用范围广的R-loop检测技术，用于R-loop研究工作。本研究旨在通过改进基因组DNA提取方法，引入单链核酸内切酶体系以及“spike-in”技术，开发出具有低样本量需求、单核苷酸分辨率、相对定量能力的新型R-loop测序技术。主要研究内容包括：一、基于绿豆核酸酶酶切技术，完成了单核苷酸分辨率R-loop测序技术的开发；二、基于“spike-in”开发完成了定量R-loop测序技术；三、绘制了拟南芥和斑马鱼在不同发育时期的R-loop图谱，并研究了R-loop在发育过程中的调控功能。技术开发结果显示，新开发的技术达到了低样本量需求、单核苷酸分辨率、相对定量三个指标。对拟南芥R-loop图谱的分析发现，R-loop在拟南芥中呈现出较高的稳定性，但在花、萌发阶段以及长时间热胁迫处理下出现较大范围的变化。对斑马鱼R-loop图谱的分析发现，R-loop在早期胚胎发育阶段呈现出显著的变化，并有可能参与了合子基因激活过程的调控。综合以上结果，本项目开发了单核苷酸分辨率R-loop测序技术，为R-loop研究工作的拓展提供了有力的工具。对拟南芥及斑马鱼R-loop的研究揭示了R-loop一系列的特征，为后续研究提供了重要的数据基础和理论支持。