从全基因组角度分析三核苷酸重复序列的方法和应用

Expansion of trinucleotide repeats (TNRs) are known to underlie increasing numbers of human disorders, especially hereditary neurological disorders. However, analyzing TNRs remain methodologically challenging. In our previous study, we have developed the ZIP-seq (zinc finger protein-based immunoprecipitation and sequencing) approach that enriches CAG repeats-containing DNAs for high-throughput targeted sequencing. Application of ZIP-seq and associated algorithm offers genome-wide mapping of TNRs in the human genome at single base resolution. In this application, we will expand target sequences of zinc finger protein to all TNRs involved in neurological disorders. In parallel ZIP-seq method would further facilitating the discovery of disease-associated genes from rare hereditary neurological disease samples. And we also use in parallel ZIP-seq method to evaluate TNR polymorphisms during passages and differentiation processes of ES or iPS cell lines, thus assessing their genome stabilities.

三核苷酸重复序列(TNR)的扩增已经被发现与越来越多的人类疾病，尤其神经系统遗传性疾病相关。但是，研究TNRs的方法，尤其是从全基因组角度上的研究仍很欠缺。在前期工作中，我们开发了基于锌指蛋白的免疫沉淀以及高通量测序(ZIP-seq)的方法来从基因组中富集涵括CAG重复序列的DNA片段，并且进行高通量测序。应用ZIP-seq技术以及相关的算法能够以单碱基分辨率从全基因组角度找出人类基因组中的TNR定位。在本申请中，我们扩展锌指蛋白的识别序列至所有与神经肌肉系统疾病相关的TNRs，通过并行ZIP-seq技术，同时分析待测样本中所有的TNRs信息，找出引发疾病的受累基因。并进一步在细胞水平和临床样本相关性分析等方面对筛查出的受累基因进行功能验证。同时我们也对ES和iPS细胞的传代及分化过程进行TNR多态性的检测，以协助评估基因组的稳定性。

重复序列区域的高度可变性是基因组不稳定性主要来源和特征之一， 也是造成人类遗传性疾病的重要原因。三核苷酸重复（Trinucleotide Repeat，TNR）过度扩增可导致多种神经系统疾病。然而TNR的多态性在复杂神经系统紊乱中所起的作用一直没有引起足够重视，也缺乏有效的研究手段。.通过分析已发表的多家系智障病人的二代测序数据，我们发现 TNR 的多态性广泛分布在多个和神经肌肉系统相关的基因上。TNR的多态性产生的混杂效应可能会影响神经系统功能紊乱和智力缺陷。我们在分析结果中发现NOTCH4存在CAG重复序列的缩减，进一步实验显示其对应编码的信号肽中亮氨酸减少导致 NOTCH4自身蛋白的减少而影响Notch信号通路。编码钙离子依赖-电压激活的钾通道（BK通道）α亚基的KCNMA1也存在GCC重复的缩减，通过电生理实验证实，其对应编码的细胞外N末端多聚甘氨酸的减少损坏了BK离子通道的正常生理功能。.上述结果表明，除了TNR序列的扩增，TNR序列的减少也会改变基因功能并可能导致疾病发生。在今后遗传疾病研究中，我们有必要将TNR多态性的分析纳入到二代测序数据分析的常规流程中，并探索TNR多态性的功能，以期找出未知的参与疾病发生的关键基因，为研究疾病发病机制提供新思路。