液氦玻璃化冷冻对牛GV期卵母细胞结构、组份和发育能力的影响

GV期卵母细胞冷冻可以为放疗癌症患者保存生殖能力；为体外受精、克隆、转基因等胚胎生物技术研究提供充足的实验材料；同时，对珍稀、濒危动物资源保护具有重要价值。目前，牛GV期卵母细胞的冷冻成功率极低。本课题拟以牛GV期卵母细胞为实验材料，以解冻后卵母细胞细胞骨架、组份变化及体外受精后的发育能力为评定指标，首次采用液氦（-269℃）替代液氮（-196℃）为冷源对卵母细胞进行玻璃化冷冻，提高冷冻速率并适当降低冷冻保护剂浓度，用免疫荧光标记法对比观察冷冻速率对卵母细胞骨架的影响，首次采用拉曼光谱法检测冷冻速率对卵母细胞组份和功能的影响，在冷冻速率和冷冻保护剂浓度的变化中研究GV期卵母细胞冷冻损伤的发生规律，建立用液氦冷冻牛卵母细胞的新方法，探索用拉曼光谱检测卵母细胞组份和功能变化的新途径，为提高牛GV期卵母细胞冷冻成功率奠定理论和方法基础，为相关研究提供一个全新的视角和途径。

GV期卵母细胞冷冻可以为放疗癌症患者保存生殖能力；为体外受精、克隆、转基因等胚胎生物技术研究提供充足的实验材料；同时，对珍稀、濒危动物资源保护具有重要价值。目前，牛GV期卵母细胞的冷冻成功率极低。本课题以牛GV期卵母细胞为试验材料，以液氦（-269℃）替代液氮（-196℃）为冷源进行玻璃化冷冻，取得了如下成果：.（1）建立了液氦玻璃化冷冻牛GV期卵母细胞的新方法。卵母细胞经冷冻、解冻后，液氦组卵母细胞形态正常率（89.0%）显著高于液氮组（81.1% ；P<0.05）；经IVM后，液氦组卵母细胞成熟率（50.6%）显著高于液氮组（42.6% P<0.05）；经IVF和胚胎IVC后，液氦组卵母细胞的卵裂率（41.1%）和囊胚率（10.0%）显著高于液氮冷冻组（33.0%，4.5%；P<0.05）。且胚胎移植试验表明液氦玻璃化冷冻的牛GV期卵母细胞，经解冻、IVM、IVF、IVC和ET后，可以获得正常的犊牛。结论：用液氦玻璃化冷冻法冷冻牛GV期卵母细胞的方法是可行的，且其效果优于液氮玻璃化冷冻。.（2）筛选了液氦玻璃化冷冻的保护剂及浓度。结果表明：以EG和DMSO为冷冻保护剂、以液氦为冷源时的最佳的冷冻保护剂浓度为5.6M，这较之液氮冷冻的最佳浓度（6.6M）有所降低。.（3）初步揭示了冷冻速率、冷冻保护剂浓度与牛GV期卵母细胞冷冻损伤的关系。利用激光光镊拉曼光谱仪测定了卵母细胞液氦、液氮冷冻后代谢的变化；用免疫荧光标记法研究了液氦玻璃化冷冻对卵母细胞细胞骨架的影响；用透射电镜观察了液氦玻璃化冷冻对卵母细胞超微结构的影响；用荧光实时定量PCR测定了液氦、液氮玻璃化冷冻对牛GV期卵母细胞GDF9、ZAR1、BAX、BMP15、MATER、CDC20、p53、Kifll、ZP3和Npm2基因mRNA表达量的影响。结果不但从多个侧面验证了液氦玻璃化冷冻牛GV期卵母细胞的效果优于液氮玻璃化冷冻，而且验证了我们提出的设想，初步揭示了冷冻速率、冷冻保护剂浓度与牛GV期卵母细胞冷冻损伤的关系：当大幅度提高卵母细胞冷冻速率时，可以适当降低冷冻保护剂的浓度，从而减小高渗溶液对多种细胞器、细胞骨架及多种冷冻差异表达基因造成的损伤，增加卵母细胞解冻后的自我修复和继续发育能力。如按照此方法和思路开展胚胎的液氦冷冻研究，有望提高其冷冻效果，在动物乃至人类胚胎冷冻中具有广泛的应用前景。