基于序列变异筛选和鉴定先天性心脏病相关lncRNA

Congenital heart disease (CHD) represents the most common birth defects. However, the identified genetic variants, which are mainly composed of protein coding genes, could only explain a small fraction of all CHD cases. Recently, the noncoding regions, especially the long noncoding RNA (lncRNA) have been proven to play important regulatory roles in processes such as embryonic development and organogenesis, etc. However, few investigation of relationship between lncRNA and CHD has been reported. Our previously study revealed that sequence variants-based approach could help finding CHD-related lncRNA. To systematically reveal the association of lncRNA and CHD, we intend to select candidate CHD lncRNA genes based on perform high throughput target sequencing for 500 clinically characterized patients with CHD and 500 normal controls，and combinate with co-expression analysis using cell models to identify CHD associated lncRNAs; Furthermore, regulatory mechanism would also be investigated by knock-down or over-expression CHD associated lncRNA. The project would from the variants point of view, reveal the role of lncRNA in the pathogenesis of CHD, help to find new biomarker of CHD and provide the basis for the early molecular diagnosis and intervention of CHD.

先天性心脏病（CHD）是一类最常见的出生缺陷，但目前已知的遗传变异仅能解释其中一小部分病例，且主要聚焦于蛋白编码基因。基因组非编码区尤其是长链非编码RNA（lncRNA）已被证明在胚胎发育、器官形成等过程中发挥重要的调控作用，但lncRNA与CHD的关系还鲜有报道。本课题组的前期研究结果显示，通过序列变异分析可发现与CHD致病基因表达有关的lncRNA。本研究拟依据现有的lncRNA及CHD致病基因相关信息，筛选与CHD相关的候选lncRNA；通过对500例CHD患者及500例正常对照样本进行高通量靶向测序，结合生物信息学分析及共表达实验筛选与CHD相关的lncRNA；通过敲减/过表达相关lncRNA，以揭示其导致CHD发生的机制。本项目将从序列变异角度出发，研究与CHD相关的lncRNA，将有助于发现新的CHD分子标志物，为其早期分子诊断与干预提供新的理论依据。

基因组非编码区尤其是长链非编码RNA（lncRNA）已被证明在胚胎发育、器官形成等过程中发挥重要的调控作用，但非编码区域与先天性心脏病（CHD）的关系还鲜有报道。针对非编码RNA在CHD中的调控作用，本项目研究结果如下：（1）通过全基因组测序获得了250例法洛氏四联征（TOF）患者的遗传变异信息，以千人基因组计划中国汉族人群作为对照并基于基因组非编码区罕见变异负荷的关联分析筛选出了一系列与CHD相关的lncRNA。其中，与TOF相关性最高的lncRNA（lnc-TSSK2-8）位于22q11.2区域，该区域为TOF最常发生CNV的区域。进一步研究发现，lnc-TSSK2-8主要转录本长1128bp，主要分布于细胞质中；lnc-TSSK2-8可以通过ceRNA机制调控HSPA6和CRYAB等表达从而影响心肌肥厚相关的Wnt/β-catenin通路。（2）为了揭示基因表达调控网络，本项目完成了22例TOF患儿右心室心肌组织的链特异性lncRNA转录组测序，应用因果关系推断方法，构建了TOF心肌组织中lncRNA驱动的ceRNA基因表达调控网络，并鉴定出FGD5-AS1、lnc-GNB4-1、lnc-PDK3-1和lnc-SAMD5-1等hub lncRNA。通过在细胞模型中敲减FGD5-AS1，证明其不仅可以调控PTEN、SMAD4等靶基因的表达，并且可以调控其结合的miR-454-3p及miR-421等miRNA的转录。转录组（RNAseq）及表观组（ATACseq）分析表明，ENPP2、HAS2和VIT等基因的染色质活性改变可能是FGD5-AS1调控机制的关键节点。（3）基于ENCODE数据库中不同发育期人类胎儿心脏组织的RNA芯片数据，构建了胎儿心脏特异的基因表达调控网络。（4）利用TOF患儿心肌组织微小RNA（miRNA）测序及GEO数据库TOF转录组测序数据，探讨同样位于非编码区域的miRNA在心脏发育调控和信号传导中的作用。.因此，本项目结合基因组序列变异信息及转录调控数据，筛选出一系列与CHD显著相关的lncRNA及miRNA，并对其中部分关键分子进行了功能与机制验证。本项目的研究结果将有助于发现新的CHD分子标志物，为其早期分子诊断与干预提供新的理论依据。