基于细胞代谢组学的四氢呋喃型番荔枝内酯类化合物抑制多药耐药性肿瘤细胞的作用机制研究

That metabonomics can reveal the changes of endogenous substances caused by drugs reflects the holism of traditional Chinese medicine. To find highly anti multidrug resistance tumor compound and its mechanism of action, based on the Chinese medicine theory that the seeds of Annona squamosa could treat evil sores and Annonaceous acetogenins (ACGs) which rich in the seeds could treat multidrug resistance tumors, the project using the cell metabonomics method, integrated application of a variety of detection methods (such as LC - MS, NMR, GC - MS) to obtain the metabolic spectra of ACGs on multidrug resistance tumor cells, using various statistical analysis method to find out the markedly different metabolites as potential biomarkers from complex metabolic data to build the metabolic pathway, analyzing the possible pathways or targets, with confirmtion by biological methods, so as to reveal its action mechanism; Clarifying the effects to metabolites caused by the tetrahydrofuran ring, the number of hydroxyl, the length of carbon chain, finding the compounds with highly selective activity. Therefore, the study of the ACGs’ action mechanism to clarify its metabolites and action pathways based on the cell metabonomics, has a certain social and economic value for new drug and resources reasonable development of this kind of compounds.

以代谢组学为手段从整体上揭示药物引起的内源性物质变化体现了中医药的“整体观”思想。本项目以发现高活性抗多药耐药性肿瘤的化合物类型及作用机制为目标，以番荔枝子治疗恶疮肿痛的中医理论为基础，以其富含的对多药耐药性肿瘤有确切药效的番荔枝内酯类化合物为切入点，采用细胞代谢组学方法，整合应用LC-MS、NMR、GC-MS等检测方法获得系列四氢呋喃型番荔枝内酯类化合物作用于多药耐药性肿瘤细胞的代谢谱图，采用多种统计学分析方法从复杂的代谢数据中找出差异明显的代谢物作为潜在的生物标记物，构建代谢通路，分析药物可能的作用靶点，并以生物学方法进行验证，从而揭示其作用机制；并阐明该类化合物结构中四氢呋喃环、羟基个数、及碳链长短对代谢物的影响，由此发现具高选择性的结构类型。因此，进行基于细胞代谢组学的番荔枝内酯类化合物的作用机制研究，阐明其代谢产物及作用通路，对这类化合物的新药研制及资源合理开发都有一定的价值。

本项目基于四氢呋喃型番荔枝内酯抗癌活性强，对多药耐药（MDR）肿瘤细胞抑制作用确切，提出以中医药的“整体观”作为指导思想，细胞代谢组学作为手段进行活性成分的发现及作用机制研究，寻找番荔枝内酯在体内的抗肿瘤调节通路和靶点，为ACGs的结构修饰提供理论指导。. 本项目从番荔枝子中分离得到化合物111个，其中番荔枝内酯（ACGs）105个，ACGs 新化合物65个，23个为首次从该植物中发现，并确定了20个新ACGs的立体构型。. 综合利用NMR、LC-MS、GC-MS技术，选取正常组、肿瘤组、MDR肿瘤组和给药组，利用多元统计学方法，筛选出抗MDR肿瘤及逆转MDR的差异代谢物。. 对四种类型ACG代谢组学研究结果，邻双THF环型 ACG的活性较好。进而对邻双型ACGs抗MDR肿瘤的构效关系研究表明：a.GC-MS：γ-内酯环与THF环之间的C数越少、游离-OH越接近碳链末端活性越强；3个-OH强于2个-OH。 b. LC-MS：内酯环与THF环间碳数为13时，活性较好；3个-OH强于2个-OH。. 基于细胞代谢组学的邻双型ACGs的抗MDR肿瘤机制研究结果：GC-MS共检测到5条高度相关的代谢途径。LC-MS和NMR的非靶向代谢组学研究发现，ACGs能抑制MDR肿瘤细胞的氧化磷酸化、脂质合成和快速增殖，从而发挥抗MDR肿瘤的活性。并通过检测GPD1和PRPS蛋白的表达量，验证了ACG能抑制MDR肿瘤细胞的脂类生物合成和核苷酸生物合成的结论。. 首次探讨了ACGs上取代羟基构型对活性的影响，发现S构型羟基取代ACGs抑制MDR肿瘤细胞增殖和抑制耐药蛋白MRP2、MDR1及ABCG2表达能力均较强。MTT法检测35个ACGs对3种多药耐药肿瘤细胞的IC50，均表现出抑制作用，并体现了一定的选择性。. 项目发表学术论文29篇，其中SCI收载15篇，中文核心期刊13篇。获得专利授权3项。培养博士研究生2名，硕士研究生4名。以本项目研究为基础，成功申报并获批省研究生创新项目1项，大学生创新项目2项。. 本项目的研究模式可为将中医药的“整体观”为指导思想进行中药活性成分的发现及作用机制的研究提供借鉴；阐明ACGs的抗耐药肿瘤的作用机制，对ACGs的新药研制及自然资源的合理开发利用都具有直接或潜在的社会和经济价值。