Nrf2抑制因子的发现及其逆转肿瘤细胞多药耐药性机制的研究

In this project, the symbiotic fungi sourced from Enteromorpha prolifera were used as research object. The epigenetic modification strategy was used to activate the genes which were silenced under routine culture conditions, to fully express its metabolic pathways and biosynthesis pathways. The Nrf2 protein in the Keap1-Nrf2-ARE pathway was used as a screening model to screen strains with Nrf2 inhibitory activity, which were used as target strains. Using modern chromatography technology and modern spectroscopy, the secondary metabolites were isolated and identificated. Adriamycin-resistant human hepatoma cell line BEL-7402/ADM was used as an in vitro model to screen small molecule Nrf2 inhibitors which could reverse tumor cells drug-resistant or improve drug sensitivity. The changes of expression of GCr, GCLM, GRS, MDR1/ABCB1, MRPs/ABCCs, BCRP/ABCG2 and BCL-2 in the downstream of Nrf2 were analyzed, to elucidate the reverse drug-resistant or drug sensitization mechanism by Keap1-Nrf2-ARE pathway small molecule inhibitors. According this project, to find some small molecules Nrf2 inhibitors which can reverse drug resistance or improve drug sensitization of tumor cells, and initially explain its mechanism. To provide small molecules and microbial resources for the development of anti-tumor drugs.

本项目以浒苔来源的共附生真菌为研究对象，运用表观遗传修饰策略，激活其常规培养条件下的沉默基因，使其代谢途径和生物合成途径充分表达。以Keap1-Nrf2-ARE通路中的Nrf2蛋白为活性筛选模型，筛选具有Nrf2抑制活性的菌株做为目标菌株。运用现代色谱技术分离、现代波谱技术鉴定其次级代谢产物结构。以人肝癌阿霉素耐药细胞BEL-7402/ADM为体外活性模型，筛选能够实现逆转肿瘤细胞耐药或具有药物增敏活性的小分子Nrf2抑制因子。通过检测Nrf2下游因子GCLC、GCLM、GRS、MDR1/ABCB1、MRPs/ABCCs、BCRP/ABCG2、BCL-2等表达量的变化，阐明Keap1-Nrf2-ARE通路小分子抑制剂逆转肿瘤细胞耐药或药物增敏的作用机制。通过本项目，发现具有逆转肿瘤细胞耐药或药物增敏作用的小分子Nrf2抑制剂，并初步阐释其作用机制。为抗肿瘤药物的研发提供小分子和微生物资源。

本项目开发以 Keap1-Nrf2-ARE 通路为靶点的Nrf2小分子抑制剂，作为化疗增敏剂与抗肿瘤药联用，增加或恢复 MDR 细胞对化疗药的敏感性、降低耐药性，从而改善化疗药的治疗。.通过研究，运用表观遗传修饰激活了5株真菌沉默基因表达；从其代谢产物中制备Keap1-Nrf2-ARE通路抑制剂；通过BEL-7402/ADM体外活性评价获得2个具有逆转肿瘤耐药或药物增敏高活性的Nrf2抑制剂。研究发现耐药株MCF/ADM细胞对ADM敏感性不高，而在ADM基础上添加化合物(±)-2、(+)-3后，显示出明显的肿瘤细胞增殖抑制活性，且显著高于ADM组，而化合物单独作用于MCF/ADM细胞时几乎无影响。说明化合物(±)-2、(+)-3发挥了逆转肿瘤细胞耐药的作用，使ADM发挥抗肿瘤活性。通Western blot检测肝癌细胞中Nrf2、HO-1的表达，结果显示：与对照组相比，添加(±)-2、(+)3后显著降低了Nrf2及其下游蛋白HO-1的表达，进一步证实了(±)-2、(+)3发挥逆转肿瘤细胞耐药、实现药物增敏，正是通过Nrf2通路抑制发挥的作用。阐明了Keap1-Nrf2-ARE通路小分子抑制剂实现逆转肿瘤细胞耐药或药物增敏的作用机制。.除此以外，本项目资助下还取得以下成果：（1）从浒苔来源真菌A. versicolor OUCMDZ-2738的次级代谢产物中发现了一个新天然化合物1，一对新的二酮哌嗪类对映异构体 (±)–2，首次拆分并阐明了三对对异构映体化合物的绝对构型 (±)-3–5。其中化合物9和10均显示出强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值分别为117.3和237.4 μM，显著优于阳性对照阿卡波糖的IC50为255.3 μM。（2）从深海真菌Penicillium sp.中分离得到3个新化合物和12个已知化合物，其中化合物21、22具有显著的海虾致死活性（LD50值分别为0.85和2.62 μg•mL−1）；吲哚生物碱类化合物7，具有较强的抗H3N2流感病毒活性（IC50值为13.88 μmol•L−1）。（3）通过硫酸二乙酯化学诱变法从海绵共生真菌Emericella variecolor XSA-07-2的化学诱变突变株M8 中发现了3 个新颖的聚酮类化合物等。.以上发现可以为新药的研发提供活性先导化合物和药理研究基础。