中国近海有毒亚历山大藻种群动态及混合营养特性的研究

常规浮游植物分类及检测技术难以实现对有毒亚历山大藻的有效监测，迫切需要发展新的藻种鉴定和检测方法。本研究将通过对该藻属藻种rDNA 序列全长（包括18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA 及两个转录间隔区ITS 和IGS）的测定和细致分析，建立该藻属的分子分类系统，获得更多适合特异性核酸标记探针设计的位点信息。建立并完善藻细胞TSA-FISH检测方法，实现对产毒基因型亚历山大藻种群的准确监测。同时，将TSA-FISH技术用于对藻细胞吞噬情况的原位分析，以揭示有毒亚历山大藻种群的混合营养特性。对提高该藻属藻种鉴定的准确性和检测工作的效率、揭示富营养化水体中有毒亚历山大藻种群动态变化的内在机制，有着重要意义。

有毒亚历山大藻藻华已经成为重要的近海环境问题，为有效防范其带来的危害，建立和发展准确的监测技术非常重要。本研究中，我们改进和发展了荧光原位杂交（FISH）检测方法，提高了亚历山大藻藻属不同基因型藻种鉴定的准确性和检测工作的效率。项目研究结果主要包括以下四个部分：1）通过对不同基因型亚历山大藻rDNA分子全长序列的综合分析，设计了不同基因型藻种的rRNA标记探针。FISH实验的结果表明，共有25个探针实现了对目标基因型亚历山大藻的特异性标记。统计分析了探针靶位点及杂交情况，指出存在以下几个适合特异性探针设计的区段，这为其它基因型亚历山大藻或其它藻种rRNA标记探针的设计提供了借鉴。2）基于两种rRNA标记探针（一种是仅与核仁中rRNA分子杂交的探针，另一种是同时与胞质及核仁中rRNA分子杂交的探针）的杂交信号在空间上是可以明确区分的，我们在FISH实验中同时使用这两种探针（它们分别被标记了FITC和Cy3这两种不同的荧光分子），实现了对目标藻细胞的双重特异性标记，建立了有毒亚历山大藻的双色荧光原位杂交检测方法。3）通过设计两种类型的rDNA标记探针（正义链探针和反义链探针）、添加核酸酶处理步骤以及杂交条件的优化选择，获得并解析了三种不同的杂交信号：探针与内转录间隔区转录物（rRNA）杂交所产生的信号，与rDNA分子上的互补序列杂交所产生的信号以及同时与上述两类分子杂交所产生的信号。4）针对rDNA ITS序列设计反义链探针，荧光原位杂交实验（rDNA FISH）的结果显示该探针有着很好的特异性。在rDNA FISH技术的基础上，改用半抗原分子（Digoxin）来标记探针，并通过对各个实验细节的条件优化，建立了有毒藻细胞的rDNA TSA-FISH检测技术。实验证明该技术的灵敏度很高，能够使目标藻细胞均标记上明亮的荧光信号。