CaWRKY8、CaWRKY14和CaWRKY32转录因子调控辣椒抗疫病的分子机理研究

The WRKY transcription factors are most important family transcription factors of plant in response to pathogen, with roles in disease resistance and signal transduction pathways. We obtained three CaWRKY transcription factor genes, CaWRKY8, CaWRKY14 and CaWRKY32 using RNA-Seq in pepper, which are strongly responsive to Phytophthora capsici. These three CaWRKY transcription factor genes are an early responsive gene to Phytophthora capsici, and strongly induced expressed by different abiotic or biotic stresses treatment, but their DNA binding properties, functions and regulation mechanism in disease resistance are not clear. The project will analyze the function of CaWRKY8, CaWRKY14 and CaWRKY32 in resistance by using over-expression transgenic plants and RNAi silencing plant, and illuminate the effect on expression of resistance-related gene at different pathogenesis, and interaction among themselves using qRT-PCR. The results will not only help elucidate the resistance mechanism to Phytophthora capsici in pepper, but also help promote the process of molecular breeding in resistant disease.

WRKY转录因子是植物响应病原菌胁迫最重要的转录因子之一，参与抗病反应及信号传导通路的调控。课题组前期利用辣椒转录组测序获得了3个强烈响应疫霉菌胁迫的转录因子CaWRKY8、CaWRKY14和CaWRKY32，发现它们属于辣椒对疫病早期应答的基因，并受多种逆境胁迫强烈诱导表达，但其结合特性、抗病功能及调控机理尚不明确。本项目拟采用转基因技术对高感材料进行CaWRKY8、CaWRKY14和CaWRKY32过表达和对高抗材料进行RNAi抑制表达，对它们的抗病功能进行分析，并利用qRT-PCR技术分析它们对PR等不同病程相关蛋白基因表达的影响，探讨CaWRKY8、CaWRKY14和CaWRKY32转录因子在抗疫病反应中的互作效应，抗病功能和调控机理。通过本研究，不仅有利于阐明辣椒抗疫病的分子机制，还有利于推动辣椒抗疫病分子育种进程，具有重要的科学意义和应用前景。

WRKY家族转录因子是植物特有的转录调控因子，在植物的生长发育、逆境胁迫应答过程中发挥重要的作用，是当前植物基因功能及表达网络调控研究中的热点。前期研究发现，转录因子CaWRKY8、CaWRKY14和CaWRKY32在辣椒抗病材料接种疫霉菌后表达量显著上升，同时基因启动子域本身含有能与WRKY转录因子结合的顺式作用元件W-Box。目前，对于WRKY转录因子在辣椒疫病抗性中的作用和调控模式尚不清楚，本研究进行相关研究具有重要的意义。主要研究成果如下：（1）构建了CaWRKY8、CaWRKY14和CaWRKY32转录因子VIGS沉默载体，对VIGS转化植株进行了疫霉菌整株和离体叶片接种，同时利用qRT-PCR技术对转录因子基因表达进行了分析，发现沉默植株个体间基因沉默效率存在差异，从2%~97%不等；单个转录因子在经VIGS沉默后的感病植株中的表达受到明显抑制，沉默双基因后植株整体感病比例和速率上升，而经三基因沉默后的植株完全感病，CaWRKY8、CaWRKY14和CaWRKY32三个转录因子之间存在协同作用。（2）结合辣椒疫病转录组、全基因组测序数据和生物信息学方法，鉴定到3个疫病抗性相关基因Unigene14360、Unigene18894和Unigene21394，分别沉默Unigene18894和Unigene21394基因后抗病材料趋于感病；同时沉默Uningene18894+CaWRKY32、Unigene21394+CaWRKY8后发现抗性植株感病率明显上升，感病速度显著加快，Uingene18894和Unigene21394可能是转录因子调控的下游靶基因。（3）结合辣椒疫病转录组和全基因组测序数据，鉴定到4个受辣椒疫病快速诱导的NAC转录因子，其中CaNAC20基因启动子域含有WRKY结合的W-box顺式作用元件，可能与WRKY存在互作效应。（4）建立了辣椒疫病高抗和高感材料子叶和下胚轴组织培养再生体系，成功构建了CaWRKY8、CaWRKY14、CaWRKY32、Unigene18894和Unigene21394基因的过表达载体，正在进行遗传转化。本项目研究结果为揭示WRKY转录因子在调控辣椒疫病抗性机制提供了重要的实验依据。本项目培养硕士研究生2名，共发表学术论文2篇，其中SCI论文1篇，另外2篇论文预期将在2020年底完成投稿发表。