脑组织特异性基因LRRC4在胶质瘤中表观遗传学机制研究

LRRC4是我室自主克隆的参与正常脑组织生长发育的脑组织相对特异性表达基因，亦是脑胶质瘤抑瘤基因。它在脑瘤组织，尤其是脑胶质瘤组织（87.5%）中表达下调或缺失，但其编码区未发现突变、缺失或重排。为了进一步揭示LRRC4基因在胶质瘤中表达下调或缺失的机制，我们克隆了LRRC4基因的启动子，该启动子为一典型CpG岛。重亚硫酸盐处理后基因组测序证实了LRRC4基因的启动子在脑质瘤细胞中存在高度的甲基化；采用甲基化酶抑制剂处理脑质瘤细胞后，可恢复LRRC4的表达。本项目拟研究LRRC4启动子甲基化对其表达的影响及其分子机制，明确LRRC4基因启动子甲基化在脑胶质瘤发生过程中的变化规律及与其相偶联的组蛋白修饰，从而初步阐明LRRC4的表观遗传学机制在脑胶质瘤发生发展过程中的作用，为脑胶质瘤的诊断或预后判断等提供新的线索。

本项目检测了LRRC4基因启动子在胶质瘤组织和细胞中甲基化状态，发现与正常的脑组织相比，其启动子在胶质瘤组织和细胞中呈高甲基化状态，其中 LRRC4启动子的甲基化与胶质瘤的病理类型及分化程度无关，但LRRC4基因的表达与其启动子的甲基化水平呈一定程度的负相关；为了明确启动子甲基化与LRRC4基因表达之间关系，采用去甲基化制剂5-Aza-CdR处理胶质瘤细胞，结果表明5-Aza-CdR能逆转LRRC4基因的甲基化状态，上调了LRRC4基因的表达，同时抑制了胶质瘤细胞的增殖，并使胶质瘤细胞阻滞于G0/G1期；LRRC4启动子的荧光素酶及绿色荧光蛋白报告载体实验显示甲基化的LRRC4的启动子丧失了其启动活性；凝胶电泳迁移实验（EMSA）及染色质免疫共沉淀实验(CHIP)实验分析表明，LRRC4基因启动子甲基化干扰了转录因子SP1和E2F1与其结合，抑制了LRRC4基因的转录；同时CHIP实验还证明了LRRC4启动子的甲基化与组蛋白H3K9三甲基化密切关联，与LRRC4基因转录抑制相关，而去甲基化与H3的乙酰化和H3K4的三甲基化密切关联，与LRRC4基因的转录激活相关。该项目初步阐明了LRRC4基因在胶质瘤中表达失活的表观遗传学分子机制，为胶质瘤的诊断及去甲基化治疗等提供了科学依据。