利用人工启动子库优化乳酸乳球菌丙酮酸代谢途径

利用代谢工程改造乳酸菌使其产生有效代谢产物成为乳酸菌研究的重要方向。丙酮酸是乳酸菌代谢途径中的重要中间产物，控制其代谢流向使之转化成双乙酰有助于提高发酵乳制品的风味，但仅凭传统基因敲除或过量表达等手段在代谢控制分析中具有一定局限性。本研究拟对乳球菌中控制Nisin生物合成的启动子PnisA进行人工改造，利用简并引物对启动子的非保守区随机突变，获得突变位点不同的启动子序列，建立人工启动子库；以绿色荧光蛋白为报告基因，通过检测荧光量确定启动子表达强弱，利用RT-qPCR技术在转录水平上进一步确定启动子的强度及稳定性。在此基础上，选择不同强度的启动子，分别表达控制丙酮酸代谢流向的关键酶NADH氧化酶基因（noxE），优化丙酮酸转化为双乙酰的最佳条件，实现乳球菌丙酮酸从乳酸发酵向双乙酰代谢的部分转化，以获得既产乳酸又产双乙酰的优良菌株。同时该技术的成功也为乳酸菌其它代谢途径的改造奠定基础。

利用代谢工程改造乳酸菌使其产生有效代谢产物成为乳酸菌研究的重要方向，传统的基因敲除或过量表达难以合理分配和优化代谢途径，利用启动子活性调解基因的表达强度是目前遗传改造中常用的操作手段。乳链菌素启动子是目前乳酸菌使用最为广泛的构建表达系统的遗传元件，使用兼并引物随机突变乳酸乳球菌HSM-22乳链菌素合成基因启动子PnisZ-2，建立了包括35个诱导型启动子和14个组成型的启动子库，强度跨越3-5个数量级，并且相邻启动子强度变化较小。序列分析发现，在-35和-10区域内碱基的任何变化均能导致启动子强度的降低，而在启动子以外的碱基变化则随机影响启动子的功能。.NADH氧化酶催化NADH转化为DAD+，NADH氧化酶活性的增强促使乳酸乳球菌由同型乳酸发酵转化为混合酸发酵。克隆乳酸乳球菌MG1363 NADH氧化酶启动子O159，采用上述同样兼并引物设计法，建立了NADH氧化酶启动子库，并在绿色荧光蛋白mRNA转录水平和β-半乳糖苷酶蛋白表达水平上证实了该启动子库的有效性和稳定性。利用强度不同的组成型启动子精确调控了乳球菌细胞内NADH/NAD+比例，实现了丙酮酸代谢流向双乙酰合成途径的部分转化，获得了即产乳酸又产双乙酰的优良菌株。.利用启动子库中最强的启动子B6，在嗜热链球菌中表达了克隆自植物乳杆菌的过氧化氢酶基因，提高了嗜热链球菌的存活率和货架期，进一步证明了所建启动子库在优良菌株遗传改造和代谢流向精细调控中的重要作用。