以CLCA为识别靶位定向诱导哮喘气道新增杯状细胞凋亡的基因干预研究

以杯状细胞数量增多为特征的"气道上皮重塑"，是哮喘气道黏液高分泌症状形成的物质基础。但目前的糖皮质激素等控制性药物无法逆转已经重塑的上皮结构。既往的资料及我们的前期研究证实：①哮喘小鼠模型具有通过凋亡途径减少新增杯状细胞的自身调节能力；②但是哮喘患者杯状细胞的促凋亡基因Bax表达水平显著低于其他人群；③胞膜高表达的特异性钙激活Cl－通道（CLCA）是识别哮喘气道新增杯状细胞的标识。 基于此，本项目拟：①构建"CLCA单链抗体-聚乙烯亚胺/促凋亡基因"的靶向载体/目的基因复合物；②通过培养细胞、哮喘小鼠研究评价此复合物的干预效果。旨在借助靶向载体的特异识别、内化功能及特异性表达控制元件（目的基因前插入CLCA启动子基因），选择性将促凋亡基因转入新增的杯状细胞，达到诱导后者凋亡、恢复气道上皮正常结构的目的。这种基因定向干预方案将为哮喘气道黏液高分泌症状的控制提供新思路，丰富气道重塑的治疗理论。

以杯状细胞数量增多为特征的“气道上皮重塑”，是哮喘气道黏液高分泌症状形成的物质基础。既往资料及课题组前期研究发现：①哮喘小鼠模型具有通过凋亡途径减少新增杯状细胞的自身调节能力；②哮喘患者杯状细胞的促凋亡基因Bax表达水平显著低于其他人群；③细胞膜高表达的特异性钙激活Cl-通道（Calcium activated chloride channel, CLCA）是识别哮喘新生气道杯状细胞的标识，也在调节黏蛋白MUC5AC合成方面扮演着重要角色；④但目前CLCA尚无特异性阻断剂。基于此，本项目旨在探讨采用特异性抗体干预的方式识别和阻断CLCA功能，从而定向诱导哮喘新增气道杯状细胞凋亡的干预策略，并探讨分子机制。最终为哮喘气道上皮重塑的病理变化、气道黏液高分泌的临床症状的防治，提供新的治疗思路，丰富气道重塑的理论。我们主要的实验结果有：（1）全基因合成小鼠mCLCA3的全长、N端及C端序列，构建原核表达载体，表达mCLCA3的全长、N端及C端重组蛋白。（2）分别采用mCLCA3全长、N端及C端蛋白免疫BALB/c 小鼠，制备出针对mCLCA3全长、N端以及C端的单克隆抗体。（3）成功构建了稳定转染mCLCA3全长的NCI-H292细胞系，转染效率达到50%以上，采用Western blot证实了转染细胞中mCLCA3相关蛋白的表达。(4)体外干预研究结果表明，针对mCLCA3全长及N端的单克隆抗体均能够抑制杯状细胞模型NCI-H292/mCLCA3的增殖；同时，发现该两种干预组细胞周期中G1期的比例明显上升，S期则下降，而针对C端的单克隆抗体则没有此功能，说明mCLCA3蛋白的活性端为N端肽段。此外，采用mCLCA3-N端单克隆抗体在抑制黏蛋白MUC5AC合成的同时，能够显著促进转染细胞凋亡。（5）在摸清哮喘小鼠模型杯状细胞产生及凋亡的规律基础上，采用mCLCA3-N端单克隆抗体对哮喘小鼠模型进行在体干预研究。结果表明，该单抗能够诱导气道上皮杯状细胞凋亡的产生，这是通过抑制Bcl-2的表达同时上调Bax的表达实现的。（6）进一步的机制研究结果表明，mCLCA3-N端单克隆抗体促进杯状细胞凋亡是通过Caspse非依赖的途径进行的。本研究的首次发现及结论，将为进一步阐明CLCA在哮喘发病中的角色及筛选防治靶位提供了理论依据。