Atg5在IFN-γ诱导的宿主细胞抑制弓形虫复制中的作用机制研究

The host immune system produces a proinflammatory cytokine, interferon γ (IFN-γ), against infection of the obligatory intracellular protozoan pathogen Toxoplasma gondii. IFN-γ stimulates the cell-autonomous innate immune response, causing the disruption of the membranes of parasitophorous vacuole (PV), which T. gondii forms inside infected cells, by IFN-γ-inducible selective autophagy. p62 autophagy adaptor link the PV to isolation membranes due to their ability to simultaneously bind the PV and LC3 on the isolation membrane. The interaction of the p62 with LC3 is mediated by ubiquitin-like conjugation reaction, but how the presence of PV is coupled to LC3 conjugation and thus isolation membrane formation is unclear. Here we will show that the p62 interact with the E3-like Atg12~Atg5-Atg16L1 complex and is capable of recruiting Atg12~Atg5-Atg16L1 to the PV of T. gondii. The recruitment of the Atg12~Atg5-Atg16L1 complex is sufficient to drive accumulation of lipidated LC3 at the PV. Since the interaction of the p62 with the E3-like Atg12~Atg5-Atg16L1 complex is outcompeted by LC3, the LC3 may displace the upstream conjugation machinery at the concave side of the isolation membrane. This molecular mechanism will give a hand of further research in the inhibition of toxoplasma.

弓形虫侵入宿主细胞时形成的纳虫空泡（PV）为其提供了逃避宿主杀伤的屏障。在IFN-γ诱导的细胞中，自噬受体p62结合于泛素修饰的弓形虫PV膜表面后，将募集LC3共轭结合的单层膜结构至弓形虫PV膜表面，并在Atg12~Atg5-Atg16L1催化作用下延伸形成闭合的双层膜结构，进而抑制弓形虫的生长。但是，p62募集LC3及其结合的膜结构的机制目前还不清楚。本项目将在p62和Atg5敲除的人及鼠细胞系的基础上，通过分别检测经IFN-γ诱导的人和鼠细胞中Atg12~Atg5-Atg16L1和LC3的定位以及对LC3共轭结合的影响，并且分别检测各蛋白的关键作用位点，从而详细阐述Atg12~Atg5-Atg16L1在调节LC3对p62修饰的弓形虫PV膜的募集过程中发挥的作用及分子机制，为进一步研究细胞抑制弓形虫感染的机制奠定基础，同时也为比较人与鼠细胞在抑制弓形虫生长的分子机制上的异同提供思路。

干扰素-γ（IFN-γ）诱导的先天性免疫应答在抑制弓形虫感染中起着重要的作用。IFN-γ介导的小鼠体内弓形虫的清除需要免疫相关GTPases（IRGs）和鸟苷酸结合蛋白（GBPs）以及自噬蛋白等的参与。然而，在IFN-γ刺激的人类细胞中，这些效应器（如IRGs）不表达或功能不显著（如GBPs）。那么，这些人类细胞如何抑制弓形虫的生长？.有报道称IFN-γ能够刺激HeLa细胞以非酸化依赖的方式抑制弓形虫的生长。另有研究发现泛素、自噬受体p62和NDP52以及LC3等均能够被招募至IFN-γ诱导的人细胞中弓形虫的PVs附近，并特异性抑制弓形虫的生长。也有研究表明，GABARAPL2而非LC3在IFN-γ诱导的小鼠清除弓形虫的过程中发挥重要功能。但是，人类细胞与小鼠细胞在IFN-γ刺激的抑制弓形虫感染的机制上存在差异。因此，验证HeLa细胞中GABARAPL2在抑制弓形虫感染中的作用至关重要。.本研究首先采用CRISPR/Cas9技术获得了GABARAPL2基因敲除的HeLa细胞系（GABARAPL2KO），并通过免疫荧光检测发现经IFN-γ诱导的HeLa细胞中GABARAPL2能够被募集至弓形虫PVs附近，并在抑制弓形虫生长的过程中发挥着关键作用；同时，我们还发现GABARAPL2并非直接结合于弓形虫PVs上，而是结合于PVs外的膜结构上。本研究在GABARAPL2KO细胞中利用转染重组质粒补回表达GABARAPL2或GABARAPL2（G116A）突变蛋白，经间接免疫荧光检测发现，在IFN-γ诱导的情况下， GABARAPL2（G116A）突变蛋白并未募集至弓形虫PVs附近，这表明GABARAPL2是通过脂化作用被募集至弓形虫PVs附近的。此外，本研究还通过间接免疫荧光检测发现GABARAPL2的正确定位和功能的发挥需要泛素及自噬受体p62、NDP52、OPTN以及自噬相关蛋白ATG5向弓形虫PVs的正确定位；而自噬受体p62、NDP52、OPTN及ATG5的缺失也严重影响IFN-γ对弓形虫的抑制作用。本研究进一步展示了一种非典型的细胞自噬途径，该途径以IFN-γ依赖性的方式抑制侵入HeLa细胞的弓形虫的生长和复制。