膜活性肽强化多功能复合微粒基因载体的构建及细胞内控释行为研究

高效低毒的基因载体的研究开发已成为当前基因治疗的主要障碍。非病毒类基因载体由于无免疫原性和良好的生物相容性，近年了受到了广泛的重视。但目前该类载体普遍转染效率低，极大地限制了其应用。本项目从基因给药的各种体内外屏障入手，借鉴病毒类基因载体的结构及功能特点，综合利用受体介导的内吞、内体/溶酶题逃逸、DNA压缩、细胞核定位等策略构建多功能复合型微粒载体。首先用鱼精蛋白或碱性的核定位信号肽压缩DNA，再将其包封于脂质体内，采用叶酸和膜活性肽修饰脂质体，通过叶酸受体介导的内吞使复合微粒能有效地进入特定细胞（肿瘤细胞），利用膜活性肽的pH敏感性使其能有效地逃离溶酶体，在细胞浆释放包载的DNA复合物，利用鱼精蛋白或核定位信号的作用使DNA有效地进入细胞核。通过研究载体各组分对基因入胞效率、胞内分布及持续表达等性能的影响，为复合型基因载体的构建提供理论依据，最终获得高效低毒的新型非病毒类载体。

本项目基于外源基因在体内传递需克服的各种屏障，借鉴病毒类载体的结构和功能，综合利用受体介导的内吞、内体逃逸、DNA压缩和细胞核定位等策略，采用叶酸、穿膜肽和鱼精蛋白等物质来构建多功能的复合微粒作为基因载体，并考察各功能单位对基因入胞和转染效率的影响。首先，研究了PEG链接的叶酸修饰脂质膜材的合成工艺。采用胆固醇为原料，与丁二酸酐反应生成半琥珀酸酯，再用双氨基化PEG为链接桥将叶酸结合到胆固醇上，制得了PEG化的叶酸修胆固醇，并通过红外光谱、核磁共振和质谱等方法对产物进行表征，确证合成了所需的脂质膜材。其次，考察了穿膜肽强化的叶酸修饰的长循环脂质体基因载体的制备方法和基因载体性能。采用了薄膜分散法制备了具长循环作用的叶酸修饰脂质体，与硬脂酰化八聚精氨酸在高温下孵育制得了多功能脂质体复合微粒。详细考察了八聚精氨酸对脂质体的粒径、电位、DNA结合能力、细胞摄取和基因转染效率的影响，证实了叶酸修饰的脂质和八聚精氨酸能显著促进外源基因入胞，但基因转染效率很差。再次，采用凝胶阻滞电泳和荧光淬灭试验考察了鱼精蛋白对DNA的压缩性能，在此基础上构建了穿膜肽强化叶酸修饰鱼精蛋白压缩的多功能复合微粒基因载体，测定其理化性质和细胞摄取行为，结果发现，鱼精蛋白能有效地压缩DNA，并促进外源基因的入胞和表达。随后，考察了复合微粒的入胞机制，分别于4℃和37℃下测定外源基因的摄取行为，证实了其摄取的能量依赖性。通过考察吲哚美辛、叠氮化钠、氯丙嗪、细胞松弛素等内吞抑制剂以及叶酸等对FITC标记的模型基因入胞效率的影响，确定了复合微粒的入胞机制主要为网格蛋白介导的内吞。最后，对复合微粒的摄取动力学和胞内分布进行了研究。结果发现6h内，随着孵育时间的延长，细胞内的平均荧光强度持续增加。以FITC标记DNA，DND99标记溶酶体，Hoechst 33342标记细胞核，采用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内的荧光分布，结果发现，不加鱼精蛋白的复合微粒的DNA主要细胞浆中，而加入鱼精蛋白的复合微粒的DNA有大量的位于细胞核中。