基于纳米材料的鸡IFN-γ、IL-4新型检测方法研究

目前国内外尚无敏感、可靠的在蛋白质水平上分析鸡γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）的检测方法，这直接阻碍了对这类免疫调节因子的研究及对家禽免疫应答的研究，而检测方法的灵敏度一直是困扰这一问题的关键所在。单克隆抗体（mAb）技术的发展极大地丰富和推动了细胞因子检测方法的发展，而纳米粒子具有信号放大作用的特性，将两者结合有助于大大提高检测方法的灵敏度，这为建立细胞因子检测方法提供新思路。本项目采用前期工作中获得的抗鸡IFN-γ、抗 鸡IL-4特异性mAb；并引入优化的纳米粒子，提高检测方法的"灵敏度"，研究纳米粒子与抗体的复合及其条件，验证其稳定性；比较纳米粒子-抗体复合物ELISA与对照ELISA在灵敏度上的差异。为进一步建立灵敏度高、特异性好的纳米放大ELISA方法提供科学依据。

本研究运用抗鸡IFN-γ(ChIFN-γ)、抗鸡IL-4(ChIL-4)特异性单克隆抗体(mAb)，分别建立检测ChIFN-γ、ChIL-4的双mAb夹心ELISA。结果表明，ChIFN-γ双mAb夹心ELISA的检测极限达125-500 pg/mL，可检测重组及天然的ChIFN-γ。且可有效测定出NDV La Sota弱毒疫苗、H5N1禽流感疫苗免疫鸡的免疫细胞经特异性抗原再次刺激后激发的抗原特异性IFN-γ水平；建立的ChIL-4双mAb夹心ELISA的灵敏度实验结果表明，可检测到为39 ng/ml 重组ChIL-4。. 为进一步提高检测方法的灵敏度，本研究引入纳米粒子，分别建立了如下方法：. 一、基于聚硫堇和纳米金自组装修饰的无标记阻抗型免疫传感器检测ChIFN-γ。在玻碳电极表面通过电化学聚合方法得到聚硫堇，自组装纳米金，将抗ChIFN-γ mAb固定到金纳米粒子表面，采用mAb与ChIFN-γ反应前后阻抗的相对变化来实现对ChIFN-γ的检测。其检测线性范围为0.10-1.0×103 ng/mL，检测限达100 pg/mL，可检测天然ChIFN-γ。. 二、基于PDDA功能化石墨烯纳米金复合材料制备无标记阻抗型免疫传感器，实现优化检测ChIL-4。在玻碳电极表面以PDDA功能化的石墨烯和纳米金复合材料固定抗体，构建新型无标记阻抗型电化学免疫传感器，快速灵敏地对ChIL-4进行检测。结果表明阻抗的相对变化值与ChIL-4浓度的对数成正比，其线性范围为0.50-5.0×103 ng/mL，检测限为500 pg/mL。. 三、流动注射化学发光免疫分析方法，快速高灵敏度检测ChIFN-γ。将mAb、氧化石墨烯和壳聚糖混合，滴涂于环氧硅烷化的玻璃片表面，然后将固定有mAb的玻璃片置于流通池中，制备传感器。结合流动注射和化学发光检测系统，采用一步夹心免疫温育，实现对ChIFN-γ定量检测。结果表明，ChIFN-γ检测线性范围为0.001-0.1 ng/mL，检测限为0.87 pg/mL，具有较高的灵敏度和特异性。可有效地检测感染鸡血清IFN-γ水平，而未感染的对照鸡体IFN-γ水平极低，差异极显著。. 本研究建立的基于纳米材料的ChIFN-γ、ChIL-4检测方法，特异性好，灵敏度高，可用于临床实际的检测。