高盐通过DNA低甲基化诱导病理性Tfh细胞分化及其在系统性红斑狼疮发展进程中的作用及机制研究

Systemic lupus erythematosus (SLE) is a life-threatening autoimmune disease with multiple system involvements. The pathogenesis of SLE remains unclear. It has been well documented that the abnormal T cells，such as abnormal follicular T helper （Tfh）cells， induced by genetic susceptibility and environmental factors contribute to the initiation and development of SLE. As a factor of environmental triggers, high salt diet has been recently revealed to promote autoimmunity by driving Th17 cells. In our previous study, NaCl is capable of promoting the progress of lupus-like syndrome in lupus-prone mice, increasing the percentage of Tfh cells and reducing the DNA methylation level of CD4+ T cells. Therefore, we hypothesize that the mechanism of high salt promoting lupus might be that NaCl promotes Tfh cell differentiation via altering DNA methylation level of CD4+T cells. Thus, this study aims to explore the target genes that are regulated by NaCl induced DNA demethylation and essential for the differentiation of Tfh cells, and in in vitro and in vivo condition, to further validate the effect of target genes in NaCl-induced Tfh cell differentiation and lupus progression. This project may reveal potential pathogenesis of SLE and provide theoretical evidence for improving the prognosis of SLE patients.

系统性红斑狼疮（SLE）是一种危害人类健康的多系统受累的自身免疫性疾病，其发病机制尚不明确。大量研究表明可能与基因的易感性和环境因素引起的T细胞异常有关，如异常分化活化的滤泡型辅助T（Tfh）细胞 。最近研究发现高盐饮食可诱导Th17细胞从而促进自身免疫疾病的发展进程。本项目前期工作发现高盐（NaCl）能明显加重狼疮小鼠狼疮样表型、升高Tfh细胞比例、降低CD4+T细胞基因组整体DNA甲基化水平。由此，我们推测高盐能促进狼疮发展，其分子机制可能是：NaCl降低CD4+T细胞中某些基因的DNA甲基化水平，从而促进Tfh细胞分化活化。本项目致力于研究NaCl通过降低何种基因的DNA甲基化水平，从而促进Tfh细胞的分化及加速SLE的发展，并在体内和体外实验中验证该基因对高盐诱导的Tfh细胞分化和狼疮表型的影响。该研究将有助于进一步揭示SLE的疾病发展机制，并为改善SLE病人的预后提供理论基础。

项目背景：系统性红斑狼疮(SLE)是一种危害人类健康的多系统受累的自身免疫性疾病，其发病机 制尚不明确。大量研究表明可能与基因的易感性和环境因素引起的T细胞异常有关，如异常分化活化的滤泡型辅助T(Tfh)细胞 。最近研究发现高盐饮食可诱导Th17细胞从而促进自身免 疫疾病的发展进程，然而高盐饮食是否能影响Tfh细胞的分化从而调控SLE的发生发展，仍不清楚。.主要研究内容：(1)NaCl 处理前后 Tfh 细胞比例和功能的比较;(2)利用甲基化 DNA 免疫共沉淀高通量测序 (MeDIP-seq)和表达谱测序，绘制 NaCl 处理前后诱导分化 Tfh 细胞的基因组 DNA 甲基化谱以及表达谱，观察 NaCl 对基因组 DNA 甲基化以及基因表达的影响;(3) 比较 NaCl 处理前后 Tfh 细胞诱导分化过程中 DNA 甲基化修饰酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)和羟甲基化修饰相关酶(TET1、TET2、TET3)的表达差异，筛选和验证 NaCl 调控的 DNA 甲基化修饰酶和羟甲基化修饰相关酶;(4)利用染色质免疫共沉淀 等方法，结合上述 DNA 甲基化谱和表达谱结果，筛选并验证 DNA 甲基化、羟甲基化修饰酶所调控的靶基因;(5)运用亚硫酸盐测序技术，检测 NaCl 处理后 Tfh 细胞的关键靶基因启动子区 CG 位点的甲基化水平变化;(6)通过体外实验下调上述实验筛选的关键靶基因，验证该基因在 NaCl 诱导的 Tfh 细胞分化中的作用;(7)在狼疮小鼠模型中验证高盐促进的疾病进程中的作用。.重要结果及关键数据：1、在人的Tfh细胞诱导分化中发现，TET2在诱导成熟的Tfh细胞中较naïve T细胞中 的mRNA及蛋白水平明显升高;NaCl在Tfh细胞诱导分化过程中能进一步增加 TET2的表达；2、运用siRNA 技术，在人的Tfh细胞诱导分化中敲低TET2的表达可降低Tfh细胞的分 化比例，当加入NaCl后，可逆转siRNA的抑制作用，恢复Tfh细胞的比例；3、甲基化芯片和表达谱芯片筛选出差异表达基因SPN；4、利用染色质免疫共沉淀(ChIP-QPCR)方法验证 DNA羟甲基化修饰酶TET2所调控的靶基因；5、高盐促进SLE小鼠疾病发展。.科学意义：为SLE患者慢病管理提供实验数据及潜在治疗靶点。