基因枪介导BMP-2基因转染治疗大段兔桡骨骨缺损的实验研究

骨缺损作为临床当中一类常见、难治的疾病，常给患者造成沉重的经济负担和生理损害，甚至最后需要接受截肢的悲剧。随着对骨再生机制的逐渐理解，基因治疗骨缺损逐渐成为可能。本实验首先构建具有生物活性的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒，通过酶切电泳、基因测序检测其正确性，然后转染NIH3T3细胞、兔骨髓间充质干细胞并测定其产生BMP-2蛋白的能力及蛋白的成骨活性。通过手术截骨造成兔桡骨中段的骨缺损以建立兔桡骨大段骨缺损的新鲜及陈旧模型，使用基因枪将含有BMP-2基因的真核表达质粒转移入骨折周围的肌肉组织及纤维疤痕组织，通过检测转染后肌肉组织、纤维瘢痕组织产生BMP-2蛋白的含量、X光、CT观察兔桡骨骨缺损愈合时间及骨痂生成、碱性磷酸酶活性的定量检测以及骨缺损愈合后新生骨生物力学测定，探讨使用基因枪介导BMP-2基因转染促进新鲜、陈旧骨缺损的新技术，为该技术进入临床奠定动物实验基础。

本实验主要研究了采用基因枪进行BMP-2基因转染治疗兔桡骨骨缺损的可行性及有效性。研究中首先构建了具有生物活性、包含有BMP-2目的基因的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒，通过酶切电泳、基因测序检测其BMP-2基因碱基序列的正确性。通过转染兔骨骼肌细胞、测定转染后细胞产生BMP-2蛋白的能力及蛋白的成骨活性，证明了质粒中包含BMP-2基因序列的正确性以及其产生BMP-2蛋白的能力，且所生成的BMP-2蛋白具有促进成骨的生物活性。通过手术截骨造成兔桡骨中段不同长度的新鲜骨缺损（0.5cm, 1.5cm, 2.0cm, 2.5cm, 3.0cm,）及陈旧（新鲜骨缺损制成后旷置8周）的骨缺损（1.5cm, 2.0cm, 2.5cm）, 使用基因枪（Biorad基因枪使用方法及参数按照基因枪使用说明书）将含有BMP-2基因的真核表达质粒pIRES2-EGFP-BMP-2转移入骨缺损周围的组织（新鲜骨缺损模型）及骨缺损周围组织+位于骨缺损断端之间的纤维疤痕组织（陈旧骨缺损模型），同时采用了rhBMP-2蛋白及空白组进行对照，使用westernblot及RT-PCR试验对干预前、干预后1、3、4周时转染后肌肉组织、纤维瘢痕组织进行BMP-2蛋白定性及半定量检测、X光观察兔桡骨骨缺损愈合时间、程度并对骨愈合程度进行半定量化后行统计学分析。研究结果提示，在兔桡骨的中段造成1.5cm的骨缺损并切除位于骨缺损周围的骨膜组织，可以比较稳定的制成由于骨缺损导致的骨不连接的动物模型；使用基因枪介导BMP-2基因转染骨折周围组织及位于骨缺损之间的纤维疤痕组织，可以明显提高骨缺损周围组织中BMP-2蛋白的含量，从而促进新鲜、陈旧骨缺损的愈合,大体观察结果显示通过基因转染形成的新生骨与自然形成的新生骨基本一致。通过以上研究，我们认为使用基因枪进行BMP-2基因的转染以促进骨缺损的愈合，是一种可行的、简便的、具有发展潜力的治疗技术与手段，但是更详尽的机理及使用方法，还需要进一步研究。