成纤维样细胞在颅脑创伤后血脑屏障继发性损伤中的作用及机制研究

The blood-brain barrier (BBB) secondary injury after traumatic brain injury (TBI) is the key to the development and prognosis of TBI, but its mechanism is unclear. To analyze BBB-related cells, the applicant applied single cell RNA-seq technology, and for the first time discovered fibroblast-like cells (FB) in the BBB, which specifically express Dcn (Nature, 2018). In our previous study, it was identified that brain-derived microparticles could open BBB and the expression of Dcn in the microparticles increased. It is reasonable to speculate that FB and its Dcn expression were closely related to BBB injury and repair. This project is intended to adopt in vitro BBB models, mice with fluorescent labeled FB, and their TBI models to: 1. Further clarify the relationship between FB and BBB injury and repair; 2. Establish FB cell lines, to observe the characteristics of Dcn secretion and FB particles’ release in the injure condition, and its effect on the reparation of endothelial cells; 3. Clarify the characteristics and effects of EGFR, VEGFR2 and their related signaling pathways by intervention of Dcn. Based on the study of FB, it will further our understanding about the molecular mechanism of BBB secondary injury after TBI, which lays a foundation for TBI research.

颅脑创伤（TBI）后血脑屏障（BBB）继发性损伤是TBI发展及预后的关键，但其机制尚不明确。申请者利用单细胞基因测序分析了BBB相关细胞基因图谱，首次在BBB中发现并定义了成纤维样细胞（FB），其特异性高表达Dcn基因（Nature，2018）。本课题组前期实验发现TBI后脑源性微粒可开放BBB，且微粒的Dcn表达升高，有理由推测FB及其Dcn表达与BBB损伤与修复密切相关。本项目拟通过体外BBB模型、荧光标记FB小鼠及其TBI模型：1.进一步明确FB与BBB损伤修复的关系；2.建立FB细胞系，观察FB在损伤状况下Dcn分泌和FB微粒释放的特征，及其对内皮细胞损伤修复的影响；3.通过干预Dcn探明内皮细胞受体EGFR、VEGFR2及其相关信号通路的变化特征及意义。通过对FB的研究，深入认识TBI后BBB继发性损伤修复的分子机制，为TBI研究奠定基础。

为了研究颅脑创伤后血脑屏障继发性损伤的分子机制，我们系统分析了近期发现的成纤维细胞和其它血管细胞，包括内皮细胞、周细胞以及平滑肌细胞。我们首先优化了CD45-CD31+双磁珠筛选的细胞提取方法，成功从脑创伤患者手术切除的脑组织中提取脑血管类细胞，通过单细胞测序以及系统的生物信息学分析，得到了组成血脑屏障的各类血管细胞在脑创伤后的单细胞基因转录组图谱。我们细化了不同类型的成纤维细胞、内皮细胞、周细胞以及平滑肌细胞，将人脑血管细胞一共分为了12个类别，其中不同亚分型的血管类细胞均发现有其独特的基因表达模式。在此基础上，为了探明脑创伤后血脑屏障的主要基因改变，我们将参与其主要构成的毛细血管内皮细胞进行差异分析，初步揭示了脑创伤后毛细血管内皮细胞的主要基因改变。另外，通过对已有的人脑细胞系进行RNA测序，我们发现了不同细胞系中基因表达量的差异，通过与小鼠脑血管各类细胞基因图谱的比较，我们发现小鼠成纤维细胞样细胞与这些人脑细胞系表达情况高度相似，证实了在人脑组织中也有类似于小鼠脑成纤维样细胞的存在。在机理研究方面，我们利用生物信息学方法，整合了三种不同的小鼠脑创伤模型的数据，揭示了脑创伤后内皮细胞变化的一个主要基因IGFBP7，并通过实验验证了其变化的潜在机制。血管周细胞因其在血脑屏障中的屏障以及免疫调节作用成为近期领域的一个重点，我们使用Pdgfb ret/ret小鼠同时结合单细胞测序技术，解释了周细胞缺失后血脑屏障细胞改变的机制。同时，为了充分利用公共数据库已有的于血管相关的基因图谱信息，我们收集整理了内皮细胞在脑创伤以及其它各种情况下的表达图谱，构建了一个小鼠内皮细胞基因表达数据库ECO。我们的研究揭示了颅脑创伤后血脑屏障继发性损伤的分子机制，并为临床诊疗提供了潜在的血管系统生物标志物，揭示的图谱特征以及数据库为血管相关的基因研究和疾病探索提供了一个有力的平台和基础。