核转录因子STAT3对耐药基因MDR1的转录调控及其肿瘤化疗意义

多药耐药特性是严重影响肿瘤化学疗效的机制之一。我们的前期研究提示，采用多种方法抑制过度活化的核转录因子STAT3不仅可直接抑制肿瘤增殖，还可降低多种肿瘤（肺癌、肝癌、结直肠癌、神经胶质瘤等）的多药耐药特性而增加化疗药物的敏感性。本课题拟进一步应用化学阻断剂、"诱骗"寡核苷酸片断、Dominant-negative载体、干扰RNA等手段，深入研究STAT3活性阻断效应对耐药肿瘤细胞的耐药基因MDR1转录的逆转作用。构建含不同长度MDR1启动子的萤光素酶报告基因质粒，确定STAT3与启动子的结合区域及启动强度；利用染色质免疫共沉淀进一步确定启动子上的结合区域及序列。在此基础上建立耐药肿瘤荷瘤动物模型，观察STAT3活性阻断抑制剂逆转肿瘤多药耐药特性并提高化疗药物疗效的体内作用，为临床应用STAT3抑制剂来逆转肿瘤多药耐药而奠定理论基础。

肿瘤细胞的多药耐药是恶性肿瘤化疗的最大障碍，而p-gp的过表达是肿瘤化疗药物耐药的主要原因。同时，对临床标本和肿瘤细胞系的研究表明耐药恶性肿瘤细胞多数伴随着癌基因STAT3转录因子的过表达。多药耐药肿瘤细胞中p-gp的过表达与STAT3高度活化之间的关系仍未得到阐明。.本研究将阐述STAT3对mdr1的转录调节。RT-PCR、Western-blotting和萤光素酶报告基因实验结果表明，在阿霉素耐药的K562/A02细胞和MCF-7/ADR细胞中STAT3过表达并高度活化。利用STAT3诱骗寡核苷酸或者STAT3化学抑制剂JSI-124抑制STAT3活性后能增加K562/A02细胞和MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性。STAT3诱骗寡核苷酸能降低mdr1的转录、p-gp蛋白的表达并增加阿霉素的胞内积聚。同时，抑制STAT3能降低mdr1启动子介导的萤光素酶表达，而用STAT3C过度活化STAT3能增加mdr1启动子介导的萤光素酶表达，同时增加mdr1的转录和p-gp的表达。对mdr1启动子区域进行转录因子结合序列的生物信息学分析发现，mdr1启动子区域含有多个潜在的STAT3结合位点。染色质免疫共沉淀实验进一步证明STAT3能与mdr1启动子结合，并且STAT3诱骗寡核苷酸抑制STAT3与mdr1启动子的结合。进一步的点突变证实+64~+72区域为STAT3的结合位点。总之，本研究证明抑制STAT3能够下调mdr1转录、降低p-gp蛋白表达并增加阿霉素耐药白血病细胞的化疗敏感性。转录因子STAT3参与mdr1基因的转录调控，STAT3为逆转化疗药物多药耐药的的潜在靶点。. “诱骗”寡核苷酸技术是通过竞争性抑制转录因子与调控区域的结合,从而改变下游基因的表达水平。与其它方法相比，具有其独到的优点，例如基因的群谱控制、序列短、易进入细胞、特异性高等，具有很大的应用潜力。STAT3、NF-κB和E2F的诱骗寡核苷酸已经在美国进行头颈癌、皮炎和自体静脉移植的临床研究（http://www.clinicaltrials.gov/ct）。我们以前的实验结果也证实了用诱骗寡核苷酸的方法抑制STAT3能在体内外降低肺癌、肝癌、胶质瘤和结直肠癌等细胞增殖，其机制为通过降低STAT3下游基因表达。实验证明了运用decoy ODN抑制STAT3通路作为基因治疗具有可行性。