一种抗病毒蛋白的酵母表达体系构建、抗病毒机制研究和重组活性肽的筛选

RC28是本项目组从野生蕈类皱盖罗鳞伞中分离得到的一种新型抗病毒蛋白。前期工作显示RC28对多种被膜病毒有较强的抑制作用，从其cDNA序列分析表明，RC28具有全新的一级结构，不属于任何已知的蛋白家族。由于RC28存在翻译后修饰现象，难于由原核体系表达出活性蛋白，本项目将研究建立该蛋白的酵母表达体系以及相应的发酵和纯化条件；本项目还将致力于对该蛋白作用机制的进一步研究，捕获并鉴定RC28作用的靶分子，结合前期工作基础，以初步勾勒RC28的抗病毒途径；最后，本项目还将研究RC28的酶解活性片段，并在此基础上构建一个高效的真核细胞的表达筛选模型，通过分子克隆技术构建多种重组多肽分子，以筛选出性质更优良的小分子抗病毒多肽。

RC28是本项目组从野生蕈类皱盖罗鳞伞中分离得到的一种新型抗病毒蛋白。前期工作显示RC28对多种被膜病毒有较强的抑制作用，从其cDNA序列分析表明，RC28具有全新的一级结构，不属于任何已知的蛋白家族。由于野生的皱盖罗鳞伞生长受到气候、季节和地域的限制，而且至今尚不能人工培养其子实体，所以想稳定、持续地纯化获取RC28蛋白十分困难。本研究致力于研究一套获得具有抗病毒活性的重组RC28的表达方法。本研究中，我们首先将RC28 cDNA序列插入pET26b(+)载体进行大肠杆菌表达，虽然在优化条件后，获得了较大比例的可溶性重组蛋白，但是活性测定表明表达蛋白的活性并不理想；我们又尝试使用了pPIC9K毕赤酵母体系表达RC28蛋白，该方法虽然产量较大肠杆菌系统低，但是获得的表达产物全部可溶，并且表现出了较好的抗病毒活性，与天然蛋白的活性接近。经过后期优化，我们已经获得了较大产率的发酵条件。在研究RC28抗病毒机制方面，我们使用了免疫共沉淀法钓取RC28可能的相互作用的靶蛋白质。质谱分析结果表明，PPAR家庭蛋白（γ）、锌指蛋白133和磷酸肌醇-3-激酶二类β亚型（PIK3C2B）可能与RC28有直接或间接的结合作用。后用Western-blot实验证实PPAR-γ的确存在于RC28共沉淀之中，而锌指蛋白133和PIK3C2B则不明确。我们也研究了RC28在细胞中的代谢速度，用含有RC28蛋白的培养基处理细胞，RC28会很快进入细胞中；如果撤除培养基中的RC28，细胞内的RC28蛋白将在3h内完全分解。而在4℃下抑制细胞转运的实验表明，RC28主要是被转运至细胞内，结合在细胞膜上的蛋白很少。本研究还构建了RC28的哺乳动物细胞表达载体，发现如果在细胞内完整表达RC28蛋白，细胞会有一定的病毒抵抗力；如果将RC28分段在细胞中表达，则发现表达前半段肽链（129个氨基酸）能够保留一定的病毒抵抗力，而表达后半段肽链（108个氨基酸）则无抗病毒能力。表明RC28抗病毒的活性中心应该在前半段的肽链中。通过本项目研究，我们建立了一个通过生物工程方法获得活性RC28的方法，初步揭示了RC28抗病毒的可能途径，初步筛选出了一个分子量更小的抗病毒活性片段。这些成果对于我们更具体的研究RC28作用机制、筛选新型的抗病毒药物以及将RC28推向产品都有重要的意义。