弹性蛋白酶对铜绿假单胞菌集群运动影响的分子机理研究

铜绿假单胞菌(PA)是临床最常见条件致病菌之一，具极强环境适应力和耐药性，其适应力和耐药性与该菌集群运动方式密切相关。弹性蛋白酶是PA重要致病物质，由lasB基因编码。课题组前期研究中发现PAO1的lasB基因敲除株(PAO1ΔlasB)完全丧失集群运动和绿脓素产生能力，但其机制尚不清楚。本研究拟检测PAO1ΔlasB株基因组表达谱改变，在此基础上，重点考察与PA集群运动密切相关的分泌、运动功能以及分泌性因子的生物合成与代谢等相关基因的表达水平改变；采用2-D电泳和胰酶消化肽指纹图谱检测膜蛋白和胞外分泌型蛋白变化；并探讨弹性蛋白酶活性与PA各类分泌型因子产量的相关性；同时观测PAO1ΔlasB株3种群体感应系统信号分子及生物膜形成有无变化。综合上述结果，分析弹性蛋白酶对PA集群运动影响的分子机理，有望为重新认识弹性蛋白酶在PA致病性和耐药性中的重要作用提供一些原创性数据和资料。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是临床上最常见条件致病菌之一，具极强的环境适应性和耐药性，其适应性和耐药性与该菌的集群运动方式密切相关。弹性蛋白酶（elastase LasB）是PA重要的毒力因子，由lasB基因编码。课题组通过构建铜绿假单胞菌PUCP-Red重组系统，进一步采用同源片段重组，筛选获得了PAO1 lasB基因敲除株（ΔLasB株），并通过类似方法构建了回补株（ΔLasB+）。利用这些菌株，研究发现lasB基因敲除后，ΔLasB株的生物膜形成能力显著降低，表现为膜上细菌吸附量明显减少，细菌间粘性多糖显著减少；而ΔLasB株集群运动显著增强；胞外分泌因子检测发现藻酸盐、鼠李糖脂合成显著升高；色素检测表明色素代谢明显改变，其中绿脓素合成明显降低，吩嗪、绿红素（褐红色色素）合成显著升高。通过生物膜上和集群运动细菌基因表达水平分析表明，PAO1 lasB基因敲除后与藻酸盐、鼠李糖、吩嗪、碱性蛋白酶等胞外分泌因子合成相关的基因表达水平显著升高，而绿脓素合成相关基因表达水平则显著降低；而编码菌株运动的鞭毛和菌毛相关基因未见明显改变。这些研究结果表明，铜绿假单胞菌LasB显著影响菌株生物膜形成及集群运动能力，且LasB对菌株胞外分泌因子如藻酸盐和鼠李糖脂的合成及色素代谢密切相关。按照计划书要求，本课题发表中文核心期刊3篇，SCI论文1篇已投出，1篇正在整理中；另一篇标注本项目资助的SCI论文已录用（现可网上检索）。