有机锶修饰脱细胞骨基质促进骨再生的作用与机制研究

Acellular bone matrix (ACBM) has been commercialized as one of the best bone grafts because of its sophisticated porous structure with interconnectivity and similar components to natural bone. However, the osteoinductivity of ACBM was reduced or lost during the process of removing cells and eliminating antigens. It is necessary to improve the osteoinductivity and bone regeneration ability of ACBM. Trace element of Strontium (Sr) has unique properties in inducing bone formation and chelating with carboxyl groups. This project aimsto synthesize novel organic compounds with matrix metalloproteinases (MMPs) sensitive substrate and carboxyl groups, which is the binding site for Sr ion. Sr ions will be mediated by carboxyl groups and decorated on the ACBM surface to improve its osteoinductivity. In this project, the methods for synthesizing organic Sr compounds and fabricating osteoinductive ACBM-Sr will be optimized. The degradation ability and Sr ion release profile will be studied. The cytotoxicity of ACBM-Sr will be evaluated with mesenchymal stem cells (MSCs). The biocompatibility and efficacy of Sr compounds for promoting bone formation will be evaluated with dude mice and goats. Furthermore, the effects of ACBM-Sr on regulating Hedgehog-Wnt/β-catenin signaling pathway in MSCs will be investigated and possible mechanism of Sr compound for inducing bone regeneration will be explored at both cellular and molecular levels. Hopefully, upon completion of this project, we expect to have developed an optimized, controlled release Sr composite biomaterial for bone grafting.

由于具有天然的三维孔隙结构和与正常骨组织相似的组份，脱细胞骨基质已成为优良的骨修复材料，并应用于临床。但由于材料制备过程中的脱细胞和消除抗原等处理，使得其骨诱导性显著降低或缺失，因此，脱细胞骨基质的骨诱导性和骨再生潜能有待改善。鉴于微量元素锶特有的骨诱导性及与羧基的螯合特性，本项目提出将锶元素与羧基及金属基质蛋白酶底物片段结合，在脱细胞骨基质表面形成可酶解的有机锶诱导层。本项目将优化有机锶的化学结构与复合工艺，研究材料的降解特性及锶离子释放行为；以干细胞为研究对象评价复合材料的细胞相容性，利用裸鼠皮下移植和山羊大段骨缺损模型评价其生物相容性及诱导骨再生的潜能；并针对与成骨密切相关的Hedgehog-Wnt/β-catenin 信号通路，探讨该新型复合材料促进骨再生的可能分子机制。

人脱细胞骨基质（Acellular bone matrix, ACBM）具有良好的生物相容性，其生物力学性质与人体天然骨组织相近，并具有优良的骨传导性，但材料自身的骨诱导能力有待提高。锶元素是人体必须的微量元素，具有促进成骨和抑制破骨的双重功能，并且在骨组织工程支架材料改性中具有广泛的应用。本项目研究发现，在0.01-10mM浓度范围内，锶离子能够促进人BM-MSCs增殖，在1-10mM浓度范围内，锶离子促进人PD-MSCs增殖，而20 mM的锶离子则明显抑制这两种细胞的增殖。在普通培养和成骨诱导培养条件下，添加0.1-10 mM 的锶离子不影响人BM-MSCs和PD-MSCs的ALP表达。在普通培养条件下，0.1-10mM锶离子在培养早期促进PD-MSCs成骨分化，但在培养后期1mM和10mM锶离子抑制部分成骨基因的表达。而在成骨诱导培养条件下，0.1-10mM锶离子均可促进PD-MSCs成骨分化，且以10mM 效果最佳。多巴胺与羧甲基纤维素通过酰胺反应形成DOPA-CMC有机涂层，1 g的DOPA-CMC涂层能够结合70 mg锶离子。经DOPA-CMC涂层修饰后，ACBM-Sr的三维结构没有发生改变，但是材料的表面更加细腻。锶元素在ACBM-Sr表面分布均匀，主要 以螯合态的形式存在，并且部分锶元素取代HA中的钙元素。ACBM-Sr能够释放锶离子，但是在浸泡初期存在“爆释”现象，随 后进入稳定的缓释期。ACBM-Sr 具有良好的细胞相容性，人BM-MSCs在材料表面生长良好;浸提液实验显示，单纯DOPA-CMC涂层的细胞相容 性较差，但在有机涂层上负载锶离子后，材料的细胞相容性得以改善；ACBM-Sr能够促进人BM-MSCs成骨基因和ALP的表达; ACBM-Sr具有良好的组织相容性，皮下植入后不引起裸鼠主要内脏的病变；但是ACBM-Sr的异位成骨能力没有得到提高，植入皮下5个月后仍没有新骨形成。