完全氨氧化菌在我国典型农田土壤中的丰度及氨氧化活性研究

Ammonia oxidation is the rate-limiting and key step of nitrogen cycling in agricultural ecosystem, which has been considered to be mainly carried out by ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and ammonia-oxidizing archaea (AOA). However, the discovery of a new ammonia-oxidizing microorganism, complete ammonia-oxidizing bacteria (CAOB), in 2015 broke the traditional concept. Therefore, it becomes an emerging frontier scientific issue to identify the abundance and ammonia-oxidizing activity of CAOB in agricultural soils. Aiming at this issue, this study planned to take 4 kinds of Chinese typical agricultural soils as research objects and the following researches would be carried out: First, taking CAOB functional gene Com-amoA as the molecular marker, the CAOB abundances in the agriculture soils will be explored using the newly designed specific primer and fluorescence real-time quantitative PCR technology. Then, the diversity and phylogenetic characteristics of Com-amoA gene will be elucidated by high-throughput sequencing technique and their correlations between the environmental factors will be further analyzed. Finally, the ammonia oxidizing activity of CAOB and the dominant microorganisms driving ammonia oxidation in the soils will be revealed using DNA stable isotope probe (DNA-SIP) technology. This study is of great theoretical and practical significance to acquire new understanding of the microbial community and function of ammonia-oxidizing microorganisms in agricultural ecosystem.

氨氧化作用是农田生态系统氮循环的限速步骤与关键环节，该过程一直被认为主要由氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）负责完成。然而2015年一种新型氨氧化微生物——完全氨氧化菌（CAOB）的发现打破了这一传统观念。因此，认清农田土壤中CAOB的丰度特征及其发挥的氨氧化作用成为新出现的前沿科学问题。针对这一问题，本项目拟以我国4种典型农田土壤类型为研究对象开展以下研究：首先以CAOB的功能基因Com-amoA为分子标记，利用新设计的特异性引物和荧光实时定量PCR技术探究农田土壤中CAOB的丰度；然后利用高通量测序技术阐明Com-amoA基因的多样性和系统发育特征，并解析与各环境因子之间的相关关系；最后利用稳定性同位素核酸探针（DNA-SIP）技术揭示农田土壤中CAOB的氨氧化活性，以及驱动氨氧化作用的主导微生物。本研究对重新认识农田生态系统中的氨氧化微生物群落及功能具有重要的理论与现实意义。

氨氧化作用是农田生态系统氮循环的限速步骤与关键环节，该过程一直被认为主要由氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）负责完成。完全氨氧化菌（CAOB）的发现打破了人们的传统观念，其可以独自完成以往需要AOB 和NOB“合作”才能完成的硝化作用。本研究设计了可同时覆盖CAOB amoA基因clade A和clade B的特异性引物，并以此为分子生物学标记，定量分析了多种环境样本中CAOB的种群数量和群落结构特征，发现CAOB普遍存在于农田土壤、河流沉积物、潮间带、饮用水和污水处理系统中，且在水处理系统中丰度高于传统氨氧化微生物。系统发育分析表明，5种生态系统均存在CAOB amoA基因的A分支，而B分支仅存在于土壤和沉积物中。将A分枝进一步划分为4个亚簇，其中N. nitrosa亚簇是活性污泥样品中CAOB amoA的主要组成部分，一个新的土壤簇在农田土壤中占主导地位。为了探明有效铵浓度对CAOB以及传统氨氧化微生物AOB和AOA的影响，本研究通过在不同梯度的铵浓度下对典型农田土壤进行培养，发现CAOB仅在空白和低的铵浓度下显著增长，表明了其类似于AOA适于寡营养环境的生态位，但比AOA能耐受更广的铵浓度。系统发育和皮尔逊相关分析表明，CAOB amoA的B分支主导了硝化过程。本研究还探究了土壤硝化抑制剂对CAOB的影响，通过使用不同梯度浓度的3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）和双氰胺（DCD）对典型农田土壤进行微宇宙培养，发现DMPP和DCD的使用显著抑制了AOB和CAOB的生长，而对AOA影响并不显著。本研究揭示了CAOB发挥的氨氧化作用，为全面认识农田土壤中的氮循环转化规律奠定了基础。