基于NOD2/RIP2轴介导MAPK/NF-κB信号通路探讨黄蜀葵花总黄酮治疗克罗恩病的作用及其机制

Crohn’s disease(CD) is one of the clinical refractory diseases. NOD2/RIP2 axis regulates the production of pro-inflammatory cytokines through mediating MAPK/NF-κB signaling pathways,which play key role in the pathogenesis and therapeutic target of CD. Our preliminary studies showed that Abelmoschus manihot (L.) Medicus and its main component total flavone of Abelmoschus manihot (L.) Medicus(TFA) attenuated the colitis of experimental mice, reduced the pro-inflammatory cytokines TNF-α、INF-γ secretion, and down-regulated the expression of p-p38 and NF-κBp65. These results indicate that regulating the overexpression of MAPK/NF-κB signaling pathways and its upstream NOD2/RIP2 axis are potential molecular mechanisms of TFA in the treatment of CD. In order to evaluate the influence of TFA in vivo and in vitro, pro-inflammatory cytokines, expression of MAPK/NF-κB signaling pathways and NOD2/RIP2 axis are detected by ELISA, RT-PCR, Western Blot, Immunofluorescence and other techniques in this study. The aim of this study is to elucidate the mechanism of TFA in the treatment of CD, and expect to provide new ideals and evidences for treatment of CD with Chinese medicine.

克罗恩病（CD）是临床难治性疾病之一。研究表明，NOD2/RIP2轴通过介导MAPK/NF-κB信号通路调控炎症细胞因子的释放是CD发生的关键机制和重要的治疗靶点。我们前期研究显示，黄蜀葵花及其主要成分黄蜀葵花总黄酮能够显著改善CD模型动物的肠道炎症，抑制TNF-α、INF-γ等促炎因子的释放，下调p-p38和NF-κBp65的表达，提示调节MAPK/NF-κB信号通路的过度表达及其上游的NOD2/RIP2轴可能是黄蜀葵花总黄酮治疗CD的潜在分子机制。本研究拟从整体动物和细胞水平，运用ELISA、RT-PCR、Western Blot、免疫荧光等技术，观察黄蜀葵花总黄酮对炎症相关细胞因子、MAPK/NF-κB信号通路以及NOD2/RIP2轴表达的影响，诠释黄蜀葵花总黄酮治疗CD的作用机制，为中医药治疗CD提供新的思路和依据。

NOD2/RIP2轴通过介导MAPK/NF-κB信号通路调控炎症细胞因子的释放是CD发生的关键机制和重要的治疗靶点。本项目建立TNBS诱导CD小鼠模型，运用不同剂量黄蜀葵花总黄酮（TFA）进行干预，观察实验动物体质量，疾病活动度指数（DAI），结肠形态学及组织学评分等，明确其治疗效果；通过ELISA、RT-PCR、免疫组化、荧光等技术检测实验动物血液样本和结肠组织样本细胞因子、MAPK /NF-κB、NOD2/RIP2等相关蛋白表达，明确TFA干预对NF-κB信号通路及对NOD2/RIP2轴的影响；通过透射电镜等技术，观察TFA干预后模型动物结肠组织自噬小体数目及形态、自噬相关标志蛋白的改变，探讨TFA是否也通过调控自噬治疗CD炎症；课题组开发了一种pH响应型纳米载药系统，包裹黄蜀葵花主要成分之一金丝桃苷(Hyp)和地塞米松(DEX)，并对其安全性、稳定性进行研究和验证，通过动物实验证实载药纳米颗粒能提高对IBD小鼠的治疗效果。.结果：①TFA能够显著改善CD模型动物的肠道炎症，随着TFA剂量的升高DAI评分指数下降，并能抑制CD相关促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL17和IL12的释放，促进抑炎因子IL-10的释放，显著降低p-IKKα/β/γ、IкB、p65、p100、p52、p-P38、p-ERK、p-JNK、NF-κB蛋白含量，抑制NOD2和p-RIP2的表达，证实调节MAPK/NF-κB信号通路的过度表达及其上游NOD2/RIP2轴是黄蜀葵花总黄酮治疗CD的分子机制。②TFA能显著增加模型动物结肠组织中自噬体数目，干预后结肠组织中自噬标志蛋白LC3和Beclin-1表达明显升高，提示TFA可以激活CD小鼠结肠自噬水平。③课题组开发一种pH响应型纳米载药系统，包裹黄蜀葵花主要成分之一金丝桃苷（Hyp）和DEX，用于靶向治疗IBD：制备后Hyp/DEX-NPs形貌为均匀的球形，平均粒径为219.2±6.2nm，Zeta电位为-39.6±5.7mV，在对DSS诱导的小鼠结肠炎实验中，证实Hyp/DEX-NPs的抗炎效果优于游离Hyp或DEX、游离Hyp/DEX和Hyp-NPs，在提高IBD小鼠模型治疗效果和降低副作用方面具有很大潜力。