汉坦病毒及结构蛋白对I型干扰素（IFN）固有免疫系统调控机理的研究

汉坦病毒（属布尼亚病毒科汉坦病毒属）是人类肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）的病原体，我国是汉坦病毒感染的主要疫区。病毒的L，M和S基因分别编码依赖RNA的RNA聚合酶（L蛋白），包膜糖蛋白Gn和Gc，和核壳蛋白（N蛋白）四种结构蛋白。汉坦病毒入侵后可通过拮抗及逃逸细胞固有免疫应答建立对宿主细胞的感染，继而引发抗病毒的免疫病理反应而致病。目前汉坦病毒感染对固有免疫的调节机制尚不明确。国内在这一领域的研究尚属空白。本课题将应用分子免疫学和分子病毒学技术观察汉坦病毒感染对I型IFN为主导的固有免疫应答通路的调节，重点研究病毒L蛋白和N蛋白与固有免疫的关系，以阐明汉坦病毒的感染机制。

汉坦病毒是人类肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）两种严重疾病的病原体。我国的重症型和轻型HFRS主要由汉滩型（hantaan virus，HTNV）和海尔（Seoul virus, SEOV）病毒所致。本项目着重研究中国境内HTNV的结构蛋白对固有免疫的调控作用。汉坦病毒包含三种结构-病毒RNA多聚酶（L蛋白），包膜糖蛋白Gn和Gc，及核壳蛋白(N)，分别由病毒的长（M），中（M）和短（S）三个基因片段编码。我们将中国汉坦病毒HTNV A9和SEO L99株的L，M和S片段的读码框架（ORF）克隆到CMV启动子表达质粒pCMV，以分别表达病毒的RNA多聚酶（L蛋白），包膜糖蛋白（Gn和Gc）和N蛋白。本课题并着重研究了汉坦病毒A9株N）和糖蛋白对固有免疫信号通路的调节作用。通过萤光素酶报告基因实验，我们发现HTNV A9病毒N和糖蛋白对I型干扰素信号通路具有调控作用；并且这种作用与病毒蛋白的表达水平有相关性。A9病毒的N和糖蛋白的低水平表达能活化RIG-I诱导的干扰素启动子活性，然而，N和糖蛋白高表达能显著抑制干扰素信号通路。高表达的N和糖蛋白均能显著抑制RIG-I、MDA5、TBK1和IRF3诱导的IFNβ启动子活性。N和糖蛋白还能剂量依赖的抑制RIG-I诱导的转录因子NFκB的活化。但N对转录因子IRF3却有一定的活化作用。进一步的实验表明，高剂量的N和糖蛋白能抑制细菌内毒素LPS和水疱型口炎病毒VSV诱导的IFNβ启动子的活性，并抑制LPS和VSV诱导的干扰素（IFNβ）和干扰素刺激基因（ISG15和MxA）的表达。最后，高剂量的N和糖蛋白能增强VSV病毒对293T细胞的感染水平。这些数据表明，致病性汉坦病毒A9 株可通过其表达的大量N和糖蛋白来抑制宿主细胞干扰素的作用，从而实现对宿主固有免疫反应的逃逸，帮助了汉坦A9 病毒在宿主体内复制，从而导致严重的疾病。