caspase-8在Fas凋亡信号传导通路中的调控作用研究

Fas诱导细胞凋亡的信号传导通路有两条（线粒体依赖或者线粒体非依赖通路），一种细胞只选择其中一条信号传导通路传导凋亡信号。凋亡信号传导通路的选择机制尚不明了，为了阐明这种选择机制，本研究拟以信号传导通路调控关键分子Caspase-8为研究的切入点，采用流式细胞仪、Western blot等方法证明Caspase-8的活化速度与细胞凋亡通路选择的非相关性，通过对比不同凋亡信号传导通路细胞Caspase-8的活化片段来明确与凋亡信号传导通路选择相关的活化片段。通过特异性抗体阻断相关的Caspase-8的活化片断来进一步明确活化片段的特异性酶切活性。最后通过抑制细胞内的磷酸化酶或者蛋白降解酶来明确产生不同caspase-8活化片段的机理。此研究的意义在于为进一步阐明Fas诱导细胞凋亡的信号传导通路的选择机制提供科学的试验数据，为开发临床化疗新药提供新思路。

Fas 诱导细胞凋亡的信号传导通路有两条（线粒体依赖或者线粒体非依赖通路），TypeⅠ型细胞通过线粒体非依赖通路传导凋亡信号，TypeⅡ型细胞通过线粒体依赖通路传导凋亡信号。一种细胞只选择其中一条信号传导通路传导凋亡信号。凋亡信号传导通路的选择机制尚不明了，为了阐明这种选择机制，本研究以信号传导通路调控关键分子Caspase-8 为研究的切入点，采用流式细胞仪、Western blot 等方法证明Caspase-8 的活化速度与细胞凋亡通路选择的非相关性。通过共聚焦显微镜观察发现TypeⅠ型细胞和TypeⅡ型细胞在Fas受体内化上无明显差别。TypeⅠ型细胞的Bid分子能够被人工合成的活化Caspase-8酶切成活化tBid分子，证明TypeⅠ型细胞的Bid分子不存在切割位点的变异，TypeⅠ型细胞不能通过线粒体传导凋亡信号不是因为Bid分子存在变异，而是缺乏活化Bid分子的特异性酶，通过特异性抗体阻断相关的Caspase-8 的活化片断来进一步明确活化片段的特异性酶切活性。通过对比不同凋亡信号传导通路细胞Caspase-8 的活化片段发现凋亡信号传导通路的选择与Caspase-8 的p18片段有关。线粒体非依赖的TypeⅠ型细胞不表达Caspase-8 的p18片段，p18活化片段只表达在线粒体依赖的TypeⅡ型细胞中。通过基因测序发现TypeⅠ型细胞和TypeⅡ型细胞的Caspase-8 活化切割位点不存在基因变异，因此Caspase-8 的活化片断的差异可能源于蛋白质的磷酸化不同或者蛋白降解酶活性的高低，最后通过抑制细胞内的磷酸化酶或者蛋白降解酶未能发现caspase-8 活化片段的差异。此研究初步阐明了Fas 诱导细胞凋亡的信号传导通路的选择机制，Caspase-8活化方式或活化程度的不同决定了凋亡信号传导通路的选择。