组蛋白乙酰化酶抑制物（INHAT）SET对食管癌细胞"间充质式迁移"的影响及机制研究

SET oncoprotein, a subunit of the INHAT (inhibitor of histone acetyltransferase) complex, is predicted to bind to histones and mask them from being acetyltransferase substrates. Currently, it has been well recognized that, epigenetic mechanisms is involved in the regulation of cancer cell migration. In previous studies we found that SET epigenetically repressed miR-30a expression, a bona fide tumor suppressor microRNA, via its association with H2B and H4 on the miR-30a promoter and masking them from being acetyltransferase substrates. In this regard, the down-regulation of miR-30a increased the expression of its targets of DOCK7 and Cofilin2, followed by the elongated, mesenchymal-type of cell phenotype, in line with the in vitro data, we also provide evidence for the existence of this signaling network in mice model and invasive ESCCs. Using this rationale, we postulate that SET is involved in ESCC mesenchymal migration through spatial regulation of DOCK7 and Cofilin2. By using “Time-Lapse Imaging”、“The Track object function of Metamorph” and 3D-reconstructions of z-sectioning，we will evaluate the role for SET in regulating migratory trajectories、dynamics、distance and migratory parameters in Two or Three-dimensional microenvironments. Using probes based on fluorescent resonance energy transfer (FRET)、immunofluorescence and Rac1 GTPase Pull-down assay, we will report on the activation and spatial distribution of Rac1 and Cofilin2. We will further discuss the distinct and unique roles for Rac1 and Cofilin2 in 3D migration strategies and in coordinating migration in 2D microenvironment. Our findings will further enrich the theoretical system of ESCC metastatic mechanisms and provide theoretical support for drug development targeting INHAT for ESCC.

SET 是组蛋白乙酰化酶抑制物（INHAT）复合体的亚基，是表观遗传修饰的重要调控分子。目前表观遗传修饰机制参与癌症的迁移运动已得到学者认可。既往研究中我们发现SET通过表观遗传修饰机制阻碍 miR-30a 转录，促进其靶基因 DOCK7 和Cofilin2 的表达，诱导食管癌细胞的“间充质式表型”，在癌组织和动物模型中也证实上述信号轴的激活。由此，推测SET信号轴参与食管癌细胞“间充质式迁移”。本项目运用“实时观测系统”、软件识别程序和“Z-系列切片”三维重建，在二维和三维培养模型中全面评价SET对食管癌细胞迁移轨迹、迁移动力、迁移深度及几何参数的影响；利用ICC、Pull-down和FRET探明靶基因Rac1和Cofilin2的激活及“空间分布”特征，且作为功能执行分子，二者的协同作用和不同分工。研究结果将进一步丰富食管癌转移机制理论体系，为针对INHAT的食管癌新药开发提供理论支持。

组蛋白乙酰化酶抑制物（INHAT）复合体的表观遗传修饰参与肿瘤生物学行为尚待阐明。本课题围绕细胞极性、胞内微细结构、伪足生成及迁移动力学等重要问题，从三个层面展开系统研究，结合运用生物信息学、表观遗传学、细胞生物学等方法，对INHAT复合体亚基SET参与调控食管鳞癌细胞极性维持及定向迁移的分子机制进行了初步研究。首先克隆构建SET过表达、及靶向SET的shRNA真核细胞表达载体（PcDNA3.1-SET与pLVX-shRNA SET），将阳性重组质粒转染EC-1或kyse-150细胞，利用荧光定量PCR和Western blot证实重组质粒在细胞中的正确表达及鉴定其干扰效率。筛选获得稳定表达SET的食管癌细胞系 pcDNA3.1-SET-EC-1及SET基因沉默型细胞pLVX-shRNA SET-kyse150作为研究对象。进而利用全基因组表达谱芯片筛选下游互作蛋白，经生物信息聚类分析，结合诱导条件下候选基因转录水平的表达情况，获得蛋白DOCK7/Rac1和cofilin，推测其参与介导SET生物学功能。再次，在二维和三维迁移模型中，运用长时间动态活细胞实时成像显微镜系统、软件识别程序和GFP标记三维成像技术，多角度、实时、定量评估SET对食管癌细胞迁移模式及迁移能力（间充质式迁移表型、迁移轨迹、迁移动力及几何参数）的影响，及定性、定位分析SET对细胞内微细结构（肌动蛋白循环、骨架收缩、黏附依赖、极化片状伪足形成及基质形变的耦联驱动）的改变。进一步利用ICC、Rac1 Pull-Down和浆-膜分离实验探明靶基因Rac1和cofilin 的激活状态及精细“空间分布”特征。并证实，在SET过表达细胞的上述多步骤、级联动态的迁移过程中，Rac1和cofilin被招募至细胞伪足最前端，作为功能执行分子，分工明确且高度协同。更进一步，我们采用系列缺失突变、双荧光报告实验及染色质免疫共沉淀证实，SET通过催化miR-30c 启动子上核心组蛋白H2B、H4脱乙酰，抑制其启动子转录活性，从而解除miR-30c对下游靶基因DOCK7及cofilin的表达抑制。最后，我们在鼠肺部克隆模型及手术切除食管癌组织中，证实SET信号调控轴的激活与食管癌转移表型的密切关联。综上所述，本研究丰富了食管癌转移机制理论体系，同时，对于认识INHATs家族成员的生物学效应提供了重要的启示性线索。