基于PI3K/AKT/mTOR/自噬和Nrf2/ARE信号通路探讨头顶一颗珠对脊髓损伤修复作用及机制

Spinal cord injury (SCI) is a common disease of the central nervous system caused by trauma, which has the characteristics of poor reversibility, high disability rate and complex complications. Owing to the complex complications, the rehabilitation therapy of SCI is very diffcult. Nowadays, there was not an effective treatment. In our previous study, we found that the trillium tschonoskii maxim, which is called "Tujia God medicine" could obviously improve the BBB score of spinal cord injury in rats, and protect the spinal cord injury. Further study showed that trillium tschonoskii maxim could reduce the production of MDA, enhance the activity of SOD in injured spinal cord tissue, as well as decrease the expression of autophagy related protein, promote the phosphorylation of Akt, however, the precise mechanism of trillium tschonoskii maxim on the protection of SCI is not clear. Therefore, in this study, we will investigate the effect and mechanism of trillium tschonoskii maxim on SCI, which can prove the theory to develop the trillium tschonoskii maxim as a new potential therapeutic drug for SCI. Western blot and immunofluorescence will be execute to detect the expression of autophagy related protein and NRF2, as well as the change of autophagy flow. RT-PCR will be used to evaluate the expression of antioxidant gene. Finally, we will use the inhibitors to investigate the function of PI3k-AKT-mTOR-autophagy pathway on SCI treatment using trillium tschonoskii maxim, furthermore, we will explore the crosstalk of PI3k-AKT-mTOR-autophagy pathway with NRF2 signaling pathway. Finally provide a theory foundation for the target therapy on SCI therapy.

脊髓损伤（SCI）是一种常见的由创伤所致中枢神经系统损伤性疾病，多发生于青壮年，病理过程复杂，康复困难，一直是临床研究的重点。迄今为止尚无有效的治疗方法。因此，探讨SCI的发病机制并寻求有效的防治药物成为研究热点。本项目将以PI3K/AKT/mTOR和Nrf2-ARE通路为主线研究不同剂量的头顶一颗珠正丁醇萃取物(TTM)对SCI大鼠的保护及自噬凋亡和氧化应激的调控机制，并进一步探索两者在功能上的相互作用。通过BBB评分、形态学检测等评估TTM对SCI的保护作用；运用Real-time PCR检测相关基因的表达，Western blot检测关键信号分子的表达及磷酸化水平，辅以免疫荧光与ELSA实验对自噬相关蛋白及Nrf2的核转位及其活性进行检测，并进一步利用PI3K/AKT/mTOR的抑制剂研究TTM对SCI自噬及氧化应激的调控机制。从而为脊髓损伤修复靶点治疗和靶点药物的筛选奠定理论基础。

脊髓损伤是各种因素所导致的脊髓组织不同程度的损害，是一个复杂的动态变化过程，包含原发性损伤和继发性损伤。脊髓损伤后常导致脊髓受损平面以下的躯体感觉和肢体运动功能出现部分障碍。如何促进 SCI 后功能恢复、提高患者生活质量具有重大意义。因此，脊髓损伤的治疗和康复是现代医学研究的热点。延龄草（TTM）具有多种生物活性，但对脊髓损伤的保护作用作用及分子机制值得探讨为延龄草苷的开发利用及探索 SCI 潜在治疗药物奠定理论基础。本实验通过建立大鼠脊髓损伤模型，用不同浓度 TTM 混悬液灌胃处理损伤大鼠和体外构建过氧化氢H2O2）诱导 PC12 细胞损伤模型，用不同浓度 TTM 进行干预，评判大鼠脊髓损伤的恢复状态，检测 PI3K/AKT/mTOR和Nrf2/ARE 信号通路及自噬相关蛋白和凋亡蛋白的改变，从而探讨延龄草苷保护脊髓损伤、抑制细胞凋亡的分子机制。结果发现1、TTM 干预后可提高大鼠 BBB 评分，抑制脊髓细胞凋亡，促进大鼠后肢运动功能恢复；2、TTM 干预 SCI 大鼠可减轻组织损伤、激活细胞自噬、抑制细胞凋亡、促进脊髓功能的恢复，可能是通过激活 PI3K/Akt/mTOR 信号通路来实现的；4、延龄草苷对大鼠脊髓损伤有保护作用，可能通过抑制组织内氧化应激反应、增加抗氧化相关蛋白Nrf2、Keap1、NQO1和HO-1的表达来改善脊髓损伤大鼠的运动功能；5、TTM 可抑制 H2O2 诱导的 PC12 细胞凋亡、提高损伤细胞的活力，可能是通过抑制促凋亡蛋白C-caspase-3 和 Bax 表达、降低 Bcl-2 水平来实现的，从而发挥保护神经细胞损伤作用；6、TTM 干预可激活 H2O2损伤 PC12 细胞内的 PI3K/Akt/mTOR 通路，促进细胞自噬进而抑制细胞凋亡，达到保护神经细胞损伤作用。头顶一颗珠在民间，因其延年益寿的功效，被土家族奉为“神药”。本项的目研究成果，为头顶一颗珠化学成分研究、药理作用研究及其作用机制研究奠定了基础。该项目的深入研究，为积极推进头顶一颗珠的产业化开发，使土家族医药走出深山，更好地为大众健康服务意义重大。