3D打印控制的牵张力调控组织血管分支形成及其机制研究

Wound repair is a common surgical procedure in clinic. The use of prevascularizated skin substitutes for wound healing is a very promising area of investigation in the field of skin tissue engineering. It is a reliable method to control the branch formation of vessels and build a multi-level branching structure for prevascularizated skin construction. It has been reported that angiogenesis could be affected by mechanical forces via Rho/ROCK signaling pathway, but the downstream molecules of Rho/ROCK are unclear. Our preliminary data showed that the direction of vessel growth and branch formation in 3D bioprinted tissues were regulated by tensile forces, which was accompanied by increased expression of YAP protein. Thus, we hypothesize that the formation of vessel branches in 3D bioprinted tissues could be regulated by tensile forces applied to tissues, and YAP may be the downstream molecule of the Rho /ROCK signaling pathway mediating the effect of tensile forces. To test the hypothesis, we will build different kinds of 3D bioprinted tissues to examine the tensile forces in the tissues and the relationship between tensile forces and the formation of vessel branches, to explore the involvement of the YAP by using two models of tensile force: cellular mechanical loading system and different shapes of frame structure of 3D bioprinted tissues. This study will elucidate the mechanisms involved in regulating vascular branch formation in 3D bioprinted tissues by tensile forces and provide experimental data for potential future clinical application.

创面修复是临床外科常见手术，制备带有血管的组织工程皮肤用于创面修复是当前创伤治疗领域的难点与研究热点，而有效控制血管分支形成、构建多级分支结构是构建类似正常皮肤血管网络的可靠途径之一。研究表明力学刺激能够影响组织血管生长方向，Rho/ROCK信号通路参与此过程调控，但下游调控机制尚不清楚。我们前期研究发现，在3D打印组织中牵张力除影响血管生长方向外，对分支形成也产生一定影响，且YAP表达不同。因此，我们提出假说：通过3D打印技术构建不同框架结构控制组织的牵张力，进而调控血管分支形成，YAP作为Rho/ROCK的下游分子可能参与此调控过程。为此，我们将构建不同框架结构的3D打印血管组织，揭示牵张力分布规律，探讨牵张力对血管分支形成的影响；通过力学加载细胞培养系统和构建框架结构施加牵张力的不同模式，验证YAP在调控过程中的作用，并验证血管功能，为3D打印皮肤组织血管化提供一定的理论和实验依据。

创面修复是创伤领域面临的主要问题。组织工程皮肤具有来源丰富、免疫原性低等特点，是临床修复创面的理想材料之一。目前商业化的组织工程皮肤因本身未建立血管系统，移植后易缺血坏死，限制了其应用。解决组织工程皮肤移植后的血液循环问题是组织工程产品推广到临床应用的前提。有效控制血管分支形成是构建类似正常皮肤血管网络的可靠途径之一。. 本课题以聚己内酯为打印组织框架结构的材料，以脐静脉内皮细胞、成纤维细胞为种子细胞，明胶、透明质酸、纤维蛋白为原材料构建 3D 打印血管组织，将含有脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的水凝胶条带固定于框架并悬浮于培养基中。细胞水凝胶复合物在组织培养过程中因细胞自身运动被框架结构限制，从而对水凝胶本身施加类似于牵张力的张力刺激。通过微弹簧结构分析6 mm、10 mm框架结构的血管组织中细胞所受牵张力的大小分别为2.4 mN、4.3 mN，整体组织免疫荧光结果显示：框架宽度越大，组织中所形成的血管分支数越少，趋向性越好，验证了牵张力对打印组织血管分支形成的调控。通过免疫荧光和PCR检测发现牵张力调控下组织中的 YAP 表达不同。随着牵张力的增加，YAP表达水平增高，加入YAP抑制剂后，血管分支数目明显增加，验证了 YAP介导的信号通路参与牵张力调控3D打印组织血管分支的形成过程。将3D 打印血管组织体外培养14天后移植至动物体内，H&E染色发现移植组织中血管管腔中存在红细胞，鼠尾静脉注射FITC标记的肝素钠实验验证了再生血管的通血功能。. 综上所述，我们的研究表明组织工程皮肤组织的血管化是一个可控的非常复杂的工程，通过对力学刺激精细调控能够实现对血管网络形成的有效控制。该研究对牵张力调控3D打印组织血管分支形成的研究提供了理论基础，为3D打印组织或器官的血管化研究提供了新思路和新方法。