ClC-3下调导致DRG神经元兴奋性增高和机械痛敏的机制研究

Our previous results have revealed that upregulation of voltage-dependent sodium channels induced by TNF-α contributes to neuropathic pain after peripheral nerve injury.Recently, we found that peripheral nerve injury decreased the expression of ClC-3 chloride channel in DRG neurons, ClC-3 knockout enhanced the excitability of DRG neurons and evoked mechanical hyperalgesia, suggesting that downregulation of ClC-3 chloride channel may play an important role in the development of neuropathic pain. However, the underlying mechanisms are not clear. Moreover, we observed that ClC-3 knockout increased TNF-α expression as well as voltage-dependent sodium currents in DRG neurons. Therefore, we hypothesized that increased inflammation and voltage-dependent sodium currents may underlie the enchanced excitability of DRG neurons in ClC-3 knockout mcie. To verify this hypothesis, we will examine the difference of intracellular chloride concentration, inflammatory response, the expression and functions of voltage-dependent sodium channels in DRG neurons between ClC-3 knockout and wild type mice using behavior test, molecular biological method and electrophysiological technique. Since previous studies mainly focused on the function of cation channels in the regulation of neuropathic pain, our present work in the role of anion channel maybe unveil the new mechanisms of neuropathic pain and discover novel therapeutic targets.

我们以往的研究表明，外周神经损伤通过TNF-α过表达，上调DRG神经元的电压依赖性钠通道，引起神经病理性疼痛。在国家自然基金青年项目资助下，我们发现外周神经损伤引起DRG神经元ClC-3氯通道下调，敲除ClC-3基因导致DRG神经元兴奋性增高和机械痛敏，提示ClC-3氯通道下调在病理性疼痛中发挥重要作用，但机制不清。我们还发现，敲除ClC-3引起TNF-α表达升高，电压依赖性钠通道电流增大，以此，我们推测ClC-3下调可能通过调控炎症反应，上调钠通道，导致DRG神经元兴奋性升高。本项目拟采用行为学、分子生物学和电生理方法，验证这一设想。研究内容包括：ClC-3下调或敲除后神经元胞内氯浓度的变化，对炎症反应的影响，及对钠通道表达和功能的作用。迄今，有关DRG神经元兴奋性升高导致病理性疼痛的研究主要集中于阳离子通道，本项目将研究阴离子通道的作用，有望揭示病理性疼痛的新机制，发现新的治疗靶点。

神经病理性疼痛是由于神经损伤或功能障碍引起的以触诱发痛、痛觉过敏及自发痛为主要表现的病理过程，其机制主要为外周敏感化和中枢敏感化。其中外周敏感化主要表现为初级传入神经元如DRG神经元的兴奋性异常增高，使痛信号产生增多。而DRG神经元的兴奋性是由细胞膜上的离子通道的数量及功能状态所决定。以往的研究表明，多种离子通道参与DRG神经元的兴奋性，从而参与神经病理性疼痛的形成，并成为有效的预防和治疗的靶点及潜在靶点。以往的研究结果表明，外周神经损伤后局部致炎症细胞因子通过上调DRG神经元电压依赖性钠通道，引起神经病理性疼痛。有关DRG神经元兴奋性增高导致病理性疼痛的研究主要集中于阳离子通道，对于阴离子通道的研究比较少。本研究表明，ClC-3蛋白在外周神经系统主要表达于DRG神经元。在外周神经损伤大鼠，DRG神经元ClC-3表达下调，敲减或敲除ClC-3基因导致DRG神经元兴奋性增高和机械痛敏，恢复局部ClC-3蛋白表达可显著减轻机械痛敏。进一步研究表明，ClC-3表达下调可调节电压依赖性钠离子通道在DRG神经元细胞膜上的表达，Nav1.3, Nav1.8, Nav1.9等表达增加，电流密度增加，DRG神经元兴奋性增高。ClC-3表达下调可上调致炎细胞因子TNF-α的表达，下调抗炎细胞因子IL-10等的表达。我们的研究结果为明确ClC-3作为防治神经病理性疼痛新的治疗靶点提供重要的理论和实验室依据。在探寻神经病理性疼痛发病机制的分子机制时，我们发现局部细胞因子微环境失平衡导致DRG神经元上离子通道的表达及功能改变，其中电压依赖性钙通道Cav2.2在DRG神经元的兴奋性变化中也起了重要作用。外周神经损伤后未受损DRG神经元高表达Cav2.2，敲减Cav2.2表达水平或抑制Cav2.2可显著降低DRG神经元兴奋性，缓解神经损伤所致的机械痛敏。该研究结果为明确Cav2.2作为防治神经病理性疼痛的新靶点提供了重要的实验依据，并进一步明确了局部促炎细胞因子和抗炎细胞因子失衡导致DRG上离子通道异常表达是神经病理性疼痛的重要机制。说明纠正炎性微环境是防治神经病理性疼痛的重要手段和策略。