lncRNA SPATA31D5P作为ceRNA调控AQP1在乳腺癌发生中的作用机制研究

According to “competitive endogenous RNAs (ceRNAs)” theory, ceRNAs communicate with and co-regulate each other by competing for binding to shared microRNAs. Our previous studies have confirmed AQP1 expression increased significantly in breast cancer compared to normal tissuse, and involved in the development of breast cancer. Microarray screening and bioinformatics analysis suggest that lncRNA SPATA31D5P may adsorb miR-320a、miR-320b、miR-3194-3p as a molecular sponge, and co-regulate AQP1 expression each other as ceRNAs. The coordinate regulation of lncRNA SPATA31D5P -miRNA-AQP1 may play an important role in tumorigenesis and development of breast cancer. This study will use the lncRNA overexpression and suppression techiniques, Luciferase assays, site-directed mutation, RNA immunoprotein and mice vivo experiment, verirify and clarify the mechanism of SPATA31D5P as ceRNA of AQP1 in breast cancer. It will help to early diagnosis with tumor markers and molecular targeted therapy of breast cancer.

竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)学说认为ceRNA能竞争性结合miRNAs从而调节miRNAs靶基因表达。申请人前期研究发现AQP1在乳腺癌组织中表达显著增高并参与乳腺癌的发生发展，通过基因芯片筛选与生物信息学分析我们发现lncRNA SPATA31D5P作为分子海绵可吸附miR-320a、miR-320b、miR-3194-3p，与AQP1互为ceRNA进行相互调控，形成lncRNA-miRNA-mRNA的协同调控关系在乳腺癌发生发展中发挥作用。因此，本课题拟采用lncRNA过表达及稳定干扰技术、荧光素酶实验、基因定点突变、RIP实验和小鼠体内成瘤实验等方法，从体内体外同时验证和阐明lncRNA作为ceRNA调控AQP1网络的作用机制，将有助于乳腺癌发生机制研究、早期诊断肿瘤标志物的应用以及分子靶向治疗。

近年来大量研究发现长链非编码RNA（LncRNA）与乳腺癌发生发展密切相关，本项目对lncRNA SPATA31D5P在乳腺癌中的生物学功能及其可能作用机制进行了研究。.申请人前期研究发现AQP1在乳腺癌组织中表达显著增高并参与乳腺癌的发生发展。通过lncRNA表达谱芯片筛选与生物信息学分析发现SPATA31D5P有可能作为ceRNA，通过其MRE与miR-320、miR-3194-3p竞争性结合从而影响及调节AQP1的表达。.本研究主要可分为三个部分：第一部分LncRNA SPATA31D5P在乳腺癌中的表达及功能研究。首先通过荧光定量PCR技术发现SPATA31D5P在各乳腺癌细胞系中表达较正常乳腺上皮细胞显著增高，同时在乳腺癌组织中的表达也较癌旁组织显著增高。功能获得及功能缺失试验发现干扰SPATA31D5P表达能有效抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡；小鼠体内成瘤实验发现干扰SPATA31D5P能有效抑制裸鼠皮下肿瘤增长。.第二部分对LncRNA SPATA31D5P与AQP1相互作用的分子机制展开深入研究。乳腺癌细胞中miR-320、miR-3194-3p和AQP1的表达存在负相关，且密切参与乳腺癌的进展。证实miR-3194-3过表达抑制BC细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。双荧光素酶报告实验证实miR-3194-3p直接靶向并抑制AQP1的表达，并且AQP1过表达可逆转miR-3194-3p对乳腺癌细胞的生物学作用。同时双荧光素酶实验和qRT-PCR证实SPATA31D5P可作为ceRNA与miR-320, miR-3194-3p竞争性结合从而影响AQP1的表达。最后通过基因表达谱芯片分析SPATA31D5P相关的差异基因及相关信号通路，进行功能分析。.第三部分通过临床标本研究，发现SPATA31D5P及miR-3194-3p的表达与乳腺癌患者年龄、瘤体大小及淋巴结转移无关，但是与乳腺癌TNM分期及远处转移有关。.综上，SPATA31D5P吸附miR320、miR-3194-3p通过AQP1及其下游信号通路调控BC细胞的迁移、侵袭和凋亡，研究结果阐明SPATA31D5P作为ceRNA 抑制乳腺癌发生发展的分子作用机制，为乳腺癌诊断、预测、预后判断及靶向治疗提供新的靶点。