pRNA－3WJ为载体的纳米微粒的构建及在脊柱结核靶向沉默结核杆菌Mce4A基因作用的研究

The compact and sclerous nidus wall caused by spinal tuberculosis is the barrier of the anti-tuberculosis drugs going into the nidus tissues, the prevalence of drug resistant/ multi-drug resistant to TB and HIV made anti-tuberculosis invalid, while targeted gene technology is expected to solve this problem. In this study, we first constructed the gene-targeted silent nanoparticles using pRNA-3WJ as a gene carriers, at the end of 3WJ, the gomphosis with the gene silencing siRNA targeting at Mycobacterium tuberculosis mce4A and RNA aptamer of CD4 molecule at CD4+ T cells surface of Mycobacterium tuberculosis. Using R-T PCR and western blot to detect the paralleled RNA and protein of Mce4A molecule and to evaluate the silencing effect of siRNA gene; radioisotope 32P, high performance liquid and liquid flash counter were used to determine the target performance of aptamer (CD4); Morphology was observed by atomic force microscope. To evaluate the targeting, gene silencing and toxicity through spinal tuberculosis in rabit model in vivo, then providing theoretical foundation of for spinal tuberculosis gene-targeted therapy, which had the significant social meaning of improving therapeutic effect of spinal tuberculosis, shorten the course and the patient can get well soon.

脊柱结核致密硬化的病灶壁是抗痨药物进入病灶组织的屏障、耐药/耐多药结核病及艾滋病的流行使抗痨失效，靶向基因技术有望解决这一难题。本研究首次拟以pRNA-3WJ为基因载体、在3WJ的末端分别嵌合针对结核杆菌Mce4A基因沉默的siRNA与靶向结合宿主CD4+T细胞表面CD4分子的RNA aptamer，构建具有靶向沉默功能的pRNA 3WJ-siRNA（Mce4A）-aptamer（CD4）纳米微粒。体外通过R-T PCR、western blot对Mce4A分子对应的RNA及蛋白质含量的检测评价siRNA基因沉默效应；以放射性同位素32P、高效液相、液闪计数仪检测aptamer(CD4)的靶向性能；以原子力显微镜观测形态。体内通过兔脊柱结核模型评价靶向性及基因沉默效应、毒性。从而为抗痨失效脊柱结核的纳米基因靶向治疗提供理论依据。对提高脊柱结核疗效、缩短疗程、患者早日康复具有重要的社会意义。

脊柱结核致密硬化的病灶壁是抗痨药物进入病灶组织的屏障、耐药/耐多药结核病及艾滋病的流行使得抗痨失效，然而靶向基因技术有望解决这一难题。针对上述脊柱结核治疗失效的机制，本课题组决定采用纳米靶向基因微粒构建的最新研究成果，来研制抗结核治疗的新药、新剂型、新给药方式。本研究采用pRNA-3WJ纳米微粒作为载体，通过在其“三路结”结构域末端分别嵌合能沉默结核分枝杆菌中Mce4a基因的siLNA、在3WJ的另一端嵌合能靶向结合位于成骨细胞表面的CD40分子的核酸适配体aptamer，来探讨pRNA 3WJ-siLNA gapmer(Mce4a)-aptamer(CD40)纳米靶向基因微粒对结核病灶组织中结核分枝杆菌的靶向杀灭作用。.本研究的结果显示如下：.1.通过分析比较脊柱结核全转录组与对照组中差异基因表达的基因芯片检测结果，发现胆固醇代谢通路在脊柱结核的发病过程中可能起着重要的作用。.2.本研究显示抑制结核分枝杆菌中Mce4a基因的表达是治疗结核病的一种有效方法，因此本课题组设计合成了抑制Mce4a基因表达的杂合反义寡核苷酸片段siLNA。而实验结果显示，siLNA片段可特异的抑制结核分枝杆菌中Mce4a mRNA的表达。.3.本研究发现，成骨细胞更适合作为脊柱结核靶向治疗的目的细胞，其表面表达的CD40分子更适合作为靶向治疗的靶标分子。同时实验证实，CD40分子所对应的核酸适配体Aptamer能与成骨细胞特异结合，并进入到细胞中。.4.本研究显示pRNA 3WJ-siLNA（Mce4a）-aptamer（CD40）纳米微粒成功构建，并且其热力学性能稳定。.5.本研究证实pRNA 3WJ-siLNA（Mce4a）-aptamer（CD40）纳米微粒可与结核分枝杆菌的成骨细胞特异结合并进入到细胞中，靶向性能良好。.6.本研究证实pRNA 3WJ-siLNA（Mce4a）-aptamer（CD40）基因纳米微粒可明显的抑制结核分枝杆菌在成骨细胞中的生长存活，且与作用浓度成正相关，其沉默性能良好。.7.本研究证实生理作用浓度(20µM)的pRNA 3WJ-siLNA（Mce4a）-aptamer（CD40）基因纳米微粒对人体的主要脏器细胞均无明显的毒性作用。.本研究结果表明构建出的pRNA-3WJ纳米微粒，具有良好的应用前景和科学意义。