石鲷科鱼类早期发育过程氧自由基(ROS)产生机制解析

Reactive oxygen species (ROS) is a kind of oxygen atoms or groups of atoms with strong biological activity of free radical containing. In recent years, The damage of active oxygen for seawater fish in early life stages has become a hot spot in the sea water fish farming. It is suggested that the emergence of high mortality is often accompanied by high expression of ROS during the period of the condition of artificial breeding. However, under the condition of artificial breeding in early life stages how the ROS are induced and accumulated? Why did the genes of mitochondrial electron transport chain dramatic change in the deactivation state? Which was connected with high expression of ROS? And a series of problems need to be further exploration. The project plan to use seabream as the research object, from the ROS, antioxidant enzymes system, electron transport chain key regulation of gene expression changes perspective to show the ROS expression patterns of time and space in the early life stages under the condition of artificial breeding. We also used RNA dot fluorescent markers to reveal gene expression and electron transport chain ROS expression changes in different development stages under different processing conditions (inhibitor and antioxidant). The implementation of this project will not only for the sea fish ROS generation mechanism of the accumulated data, but also the most important thing is to conquer the sea fish early development process.

活性氧（ROS）自由基是一类具有很强生物活性的含氧原子或原子团，近年活性氧对海水鱼类早期发育过程损伤成为海水鱼类养殖研究热点。据报道人工培育条件下海水鱼类苗种高死亡率的出现往往伴随着ROS高表达。然而人工条件下海水鱼类早期发育过程ROS是如何被诱导产生和积累？线粒体电子传递链调控基因在失活状态下为什么会产生剧烈变化？是否与ROS的高表达存在必然联系？等一系列问题都需要进一步探索。本项目拟以石鲷科鱼类为研究对象，从ROS产生、抗氧化酶系统、电子传递链关键调控基因表达变化角度阐明人工条件下ROS在早期发育过程中的时空表达模式；在此基础上采用RNA定点表达荧光标记技术，揭示在不同发育阶段不同处理条件下（抑制剂和抗氧化剂）电子传递链调控基因表达与ROS表达变化，阐明两者之间调控关系。该项目的实施不仅为海水鱼类ROS的产生机制积累了资料，最重要的是为攻克海水鱼类早期发育过程高死亡率技术提供理论支撑。

本项目以石鲷科鱼类为研究对象，通过研究发现，在受精卵孵化过程中，VC的添加会诱导与ROS清除相关的调控表达发生显著变化，有效提高受精卵的孵化率和仔稚鱼的成活率；而茶多酚TP的加入能够影响受精卵电子传递链中第一复合物和第五复合物中的Ndufv1基因和无机焦磷酸PPA1基因表达，通过两步阻断使电子传递链中的复合物Ⅰ和复合物Ⅴ发生变化，从而阻止维持受精卵正常时生理活动的ATP能量不足，从而导致条石鲷胚胎孵化后大量死亡。在仔稚鱼时期Vc和TP组对条石鲷仔稚鱼的影响途径存在差异，Vc对条石鲷仔稚鱼主要是通过免疫代谢驱动，而TP茶多酚的作用主要是通过驱动牛磺酸代谢途径，参与条石鲷仔稚鱼能量代谢，促进条石鲷仔稚鱼的快速生长。研究发现在牛磺酸代谢途径中牛磺酸接受精氨酸的胍基，在ATP-脒基转移酶催化下生成脒基牛磺酸，然后磷酸化生成磷酸脒基牛磺酸，它在低等动物中可作为一种磷酸源，参与机体的能量代谢。通过TP对KM处理后的条石鲷进行分析发现，TP短期补救对电子传递链产生的效果显著高于长期效果，茶多酚短期氧化还原补救主要是通过电子传递链复合物I、复合物III、复合物IV和复合物V基因的高表达，来实现和补充因强氧化剂导致的机体ATP能量的缺失。本项目的实施不仅为海水鱼类ROS的产生机制积累了资料，最重要的是为攻克海水鱼类早期发育过程高死亡率技术提供理论支撑。.采用化学荧光法，揭示了ROS在斑石鲷早期发育过程中的时空表达模式，由自养阶段的卵膜和卵黄囊膜表达纵深到外源性营养阶段的腹腔表达；研究首次发现采用强还原剂（茶多酚）处理斑石鲷胚胎会导致胚胎电子传递链复合物ⅠNADH-泛醌氧化还原酶黄素蛋白1基因（Ndufv1）和复合物Ⅴ无机焦磷酸酶基因（PPA1）的极低水平的表达，导致胚胎孵化后全部凋亡；采用茶多酚处理仔稚鱼（12~16DAF）和幼鱼，可以激发内源性牛磺酸途径，实现L-半胱氨酸亚磺酸（L-CSA）向氨乙基亚磺酸（hypotaurine）的高效转化表达，提高鱼体生长速度和免疫力，在此基础上，改进了石鲷育苗的技术工艺，将斑石鲷苗种成活率由不足10%提升到了30%以上。