NADPH氧化酶产生ROS参与南果梨石细胞发育的机制研究

Sclereid is one of the crucial factors impacting grit texture in pear fruit. It was demonstrated that ROS produced by NADPH oxidase play a key role in lignin formation. However, the specific and detailed roles of ROS metabolism in sclereids formation and development remain largely unclear. Our previous work found that, the level of NADPH oxidase and ROS had obvious correlation with lignin accumulation in pear fruit. In this project, the temporal characteristics of lignin and ROS generation will be studied histochemically and subcellularly. The full length of RBOH will be obtained. Its expression characteristics during pear fruit development and in different organisms will be detected by real time PCR and in situ hybridization technique. Subsequently, an assay of Agrobacterium infiltration will be carried out on unripe fruit to verify if over-expression or silence of RBOH is able to influence ROS and lignin concentrations of pear fruit. Furthermore, inhibitors of ROS generation and exogenous lignin monomers will be used to verify if production of ROS by NADPH oxidase is critical for lignin formation in pear fruit. The knowledge gained from this study will reveal the relationship between NADPH oxidase and sclereid development, as well as providing a theoretical foundation for fruit quality regulating.

石细胞是影响梨果实品质的关键因素之一，而来源于NADPH氧化酶的活性氧在木质素的聚合过程中发挥重要作用，但其在梨石细胞发育过程中的作用机制目前尚不清楚。前期研究发现，NADPH氧化酶和活性氧水平与梨果实中木质素的积累存在明显的相关性。本课题在此基础上，首先分析果实发育过程中木质素合成和活性氧发生的组织学和细胞学变化，克隆NADPH氧化酶基因(RBOH)的全长序列，通过qRT-PCR及原位杂交等方法研究分析其表达特性，解析RBOH基因的表达与活性氧及木质素代谢的关系；并在幼果中分别过表达和干扰RBOH基因，研究表达量改变对木质素积累的影响；同时利用抑制剂结合木质素单体外源饲喂，验证NADPH氧化酶通过产生活性氧调控梨果实木质素聚合的作用机制。本课题可望揭示NADPH氧化酶与石细胞发育的关系，为有效地调控梨果实石细胞的积累提供理论依据。

秋子梨品种石细胞含量较高，探索石细胞的形成过程及其影响因素对改善秋子梨果实品质具有重要意义。本课题以秋子梨品种‘南果梨’为材料，研究RBOH基因通过ROS调控梨果实木质素聚合的作用机制，以揭示RBOH及ROS与梨石细胞发育的关系，为石细胞的有效调控奠定基础。在本研究中，我们发现ROS的积累与梨果石细胞木质化密切相关。在果实发育期中，石细胞、木质素和ROS含量的动态变化呈现出类似的趋势，共聚焦显微镜和透射电镜结果进一步证明了ROS与细胞壁木质化之间的空间一致性。此外，梨果中的石细胞木质化可被DPI所抑制，NADPH氧化酶活性和ROS水平也显著降低，这在生理水平上证明了NADPH氧化酶介导的ROS对于梨果木质素生物合成的关键作用。根据原位杂交分析结果，我们预测PuRBOHF是最有可能参与梨果石细胞木质化的RBOH家族成员，并且石细胞中的PuRBOHF转录水平显著高于其他果肉组织。为了进一步明确PuRBOHF在石细胞形成过程中的作用，进行了梨幼果的瞬时表达和果肉愈伤组织的稳定转化。结果表明，RBOHF过表达的果实和愈伤组织的木质素含量显著高于对照，而RBOHF沉默则抑制了木质素的积累。在此基础上，克隆PuRBOHF启动子序列，利用Dual-Luc试验证明了PuMYB169对PuRBOHF启动子的激活作用，利用GUS报告基因方法证明了木质素代谢相关结构基因（PuPOD、PuLAC）的启动子可被外源ROS诱导。这些结果表明，PuRBOHF可被PuMYB169激活，并通过产生ROS调控木质素合成相关结构基因的转录，初步揭示了PuRBOHF基因参与梨果实木质素代谢的分子机制，相关研究结果可为探索调控梨果实石细胞含量的措施提供理论依据。