先天性心脏病伴肢体畸形拷贝数变异及其致病机理研究

Congenital heart defects are the most common birth defect，and 25% CHD have other defects in genetic syndromes. Among all the syndromes of cardiac malformations, congenital heart defects and limb deformities often occur in combination, especially upper limb deformities. More than 100 syndromes including the heart and upper limb malformations have been reported. Copy number variations is known to be more frequently associated with congenital heart defect with extracardiac defects. De novo duplications of 3p25.2 encompassing RAF1 were identified in isolated sporadic tetralogy of Fallot, and identified RAF1 as a new gene and loci in isolated sporadic tetralogy of Fallot. Gain-of-function mutations in RAF1 is known to enhance RAS-MAPK signaling pathway, and cause a disorder of dysregulate RAS-MAPK signaling pathway or RASopathies. Recently, we identified a microduplication of 3p25.2 containing the critical gene RAF1 Associated with tetralogy of Fallot with an obvious upper limb Anomaly. By constructing the biological model of mouse gene abnormal-expression for genetic research, we try to explore the pathogenic mechanism of rare copy number variation. This study aims to launch a systematic research on the mutations and CNVs in CHD with limb anomalies, and to understand how the rare copy number variations can cause CHD and limb anomalies.

先天性心脏病是最常见的出生缺陷，也可作为遗传综合征的组成部分，约25%的患者合并其他系统缺陷。其中，肢体畸形是最常见的伴发畸形，尤其以上肢畸形多见。已报道的包括心脏和上肢畸形的综合征超过100 种。已知致病性拷贝数变异更多导致伴有心外畸形的先天性心脏病，即综合征型先天性心脏病。已有研究在孤立型TOF中发现包括RAF1基因的3p25.2拷贝数重复，指明RAF1基因是TOF的致病基因。已知RAF1基因功能获得性突变可以使RAF1的表达增强，产生增强RAS-MAPK信号通路的效应，继而导致RAS-MAPK信号通路病。最近本研究小组通过SNP array芯片技术发现包含核心基因的RAF1的拷贝数微重复可导致法洛四联症为主的先天性心脏病合并严重上肢畸形。同时拟通过构建小鼠相关基因表达异常的生物模型进行遗传学研究，探讨拷贝数变异的致病机理。

先天性心脏病是最常见的出生缺陷，肢体畸形是其最常见的伴发畸形。致病性拷贝数变异更多导致伴有心外畸形的先天性心脏病，即综合征型先心病。在孤立型TOF中已发现包括RAF-1基因的3p25.2拷贝数重复，指明RAF-1基因是TOF的致病基因。已知RAF-1基因功能获得性突变可以使RAF-1的表达增强。RAF-1异常表达能够影响心脏的发育，导致心脏肥大。RAF-1 L613V型突变与野生型相比具有更强的激酶活性，该突变的小鼠能表现出努南综合征的特征。在突变小鼠中，心肌细胞和心肌成纤维细胞中的MEK和ERK在各种刺激条件下激活增加，显示RAF-1/MEK/ERK的过度激活。努南综合征常常伴随着一些骨骼的畸形，如面部的比率失调、多指。这些特征也在RAF-1 L613V小鼠模型中得到证实，提示我们RAF-1的突变可能影响了骨骼的发育。多种刺激引起的各条通路激活的ERK在成骨细胞分化中扮演者重要的作用。也有报道证实RAF-1能够调控成骨细胞的生长。但这些研究多集中于对RAF-1功能沉默后的观测，对功能过度激活尚无报道。我们收集到拇指三节指-多指并指畸形综合征三代家系1个，其中1人同时合并先心病。研究发现这1例先心病伴上肢畸形患者同时具有2个致病性拷贝数变异，即既有新发7q36.3微重复导致的拇指三节指-多指并指畸形综合征，还有新发22q11.21微缺失导致的一种紫绀型先心病。我们随后的研究发现RAF-1突变影响成骨细胞系MC3T3-E1细胞的成骨分化的作用，miR-195抑制RAF-1的效应及其对MC3T3-E1细胞的成骨分化的影响，进一步证实了miR-195通过与RAF-1直接结合抑制其表达，从而抑制RAF-1诱导的MC3T3-E1细胞的成骨分化激活作用，提示miR-195可能成为基因治疗RAF-1 L613V突变的患者骨骼畸形（努南综合征）的一种新方法。