茶树己糖激酶基因CsHXK3和CsHXK4响应低温胁迫的作用机制

Low-temperature stress seriously affects the growth and development of tea plant, the quality of new shoots and the yield of tea. The accumulation of soluble sugar in tissues under low temperature significantly improves the cold resistance of plants. Hexokinase is a bifunctional protein, which plays a critical role in phosphorylating hexoses and transducing signals from sugar. Our previous study showed as following: the contents of total soluble sugar, glucose and fructose in tea leaves increased remarkably during natural cold acclimation; the expression levels of CsHXK3 and CsHXK4 were up-regulated under low-temperature conditions; both CsHXK3 and CsHXK4 proteins located in the nucleus; CsHXK3 lacked catalytic activity of hexokinase, while CsHXK4 could phosphorylate the hexoses. In this research, we propose to analyze the gene expression patterns of CsHXK3 and CsHXK4 under low temperature, exogenous sugar treatments and in different tea cultivars with different cold resistance, and then illuminate the relationship between the expression levels of two genes and cold resistance; to identify the physiological functions of two genes under cold conditions using transgenic Arabidopsis and poplar; to detect the differentially expressed genes in transgenic plants by using transcriptome sequencing, and then analyze the expression of the corresponding genes in tea samples. The project is planning to elucidate the molecular mechanism of regulating the cold resistance of plant by CsHXK3 and CsHXK4 under low-temperature stress. This may provide an important theoretical basis for breeding tea cultivars with cold resistance, and better understanding of the mechanism about cold tolerance of tea plant.

低温胁迫严重影响着茶树的生长发育、新梢品质的形成和茶叶的产量。低温下组织积累的可溶性糖能显著提高植物的抗寒性。己糖激酶是双功能蛋白，具有磷酸化己糖和介导糖信号的关键作用。项目组前期研究表明，茶树在自然冷驯化过程中，可溶性总糖、葡萄糖和果糖含量显著增加；CsHXK3和CsHXK4基因受低温而表达上调；CsHXK3和CsHXK4定位于细胞核；CsHXK3无己糖磷酸化活性，而CsHXK4可磷酸化己糖。本研究拟通过分析CsHXK3和CsHXK4基因在低温、外源糖处理以及不同抗寒性茶树品种内的表达变化，明确二者表达丰度与抗寒强弱的关系；利用转基因拟南芥和杨树，分析二者在低温条件下的生理功能；采用转录组测序检测转基因植株的差异表达基因，并分析茶树样品内对应基因的表达变化。深入阐明CsHXK3和CsHXK4在低温胁迫下调控植株抗寒性的作用机理。为今后选育抗寒性茶树品种和揭示茶树抗寒分子机理提供理论依据。

低温胁迫严重影响着茶树的生长发育、新梢品质的形成和茶叶的产量。低温下组织积累的可溶性糖能显著提高植物的抗寒性。己糖激酶HXK是双功能蛋白，通常具备磷酸化己糖和介导糖信号的关键性作用。项目组前期研究表明，茶树在自然冷驯化过程中，可溶性总糖、葡萄糖和果糖含量显著性增加，CsHXK3和CsHXK4基因受低温诱导而表达上调，说明HXK可能参与低温驯化过程中茶树抗寒性的获得。. 本项目克隆获得了茶树中CsHXK3和CsHXK4基因cDNA全长和启动子序列，并进行了基因理化性质、蛋白质保守结构域、蛋白进化树以及启动子顺式作用元件等分析。通过qRT-PCR和GUS染色方法，分析了2个基因在植物组织中的时空表达模式，以及对不同非生物胁迫（低温、高盐、干旱、ABA、自然冷驯化）的响应表达模式。明确了CsHXK3和CsHXK4基因的表达受低温信号的诱导，且二者表达水平与组织内可溶性总糖、蔗糖、葡萄糖及果糖的含量呈正相关。. 酵母突变体功能互补试验显示，CsHXK3蛋白缺乏己糖磷酸化活性，CsHXK4蛋白具有己糖磷酸化活性。蛋白亚细胞定位分析表明，CsHXK3是能作用于细胞核和叶绿体的双定位蛋白，CsHXK4蛋白可作用于细胞核。对pCsHXK3::GUS转基因拟南芥和CsHXK3超表达拟南芥进行不同浓度外源糖处理，表明CsHXK3属于hexokinase-like类蛋白，能介导糖信号而参与调控植物的生长发育。. 对CsHXK3超表达拟南芥进行4°C低温处理，相比野生型，发现超表达株系在低温胁迫下生长状态良好，叶片电解质渗出率显著性降低，Fv/Fm、可溶性总糖、蔗糖、葡萄糖和果糖含量上升，表明CsHXK3能提高植物的抗寒能力。低温胁迫下，CsHXK4超表达拟南芥株系的叶片电解质渗出率高于野生型，表明CsHXK4基因不能增强植物的耐寒性。. 转录组分析发现，相比野生型，在常温和低温条件下，因CsHXK3转基因因素而在超表达株系内共有682个上调DEGs和244个下调DEGs；相比野生型中对低温信号响应的基因，超表达株系内共有965个特异上调DEGs和1259个特异下调DEGs。基于DEGs的功能注释及GO功能富集分析，我们认为激活的CBF低温响应途径和钙离子信号途径、上调的COR冷调控基因以及改善的可溶性糖含量是CsHXK3超表达拟南芥抗寒能力增强的关键原因。