microRNA-Hfq复合物介导PBP突变非依赖肺炎链球菌耐药性及其表达调控机制

Recent studies found the penicillin-binding protein (PBP) mutation-independent drug resistance of Streptococcus pneumoniae, but its resistance mechanism is unknown. Previous literatues reported that inactivation of StkP kinase and CiaR response regulator of S. pneumoniae caused PBP mutation-independent drug resistance and ccn-microRNAs-encoding genes may be the target genes of CiaR. Our previous study found that knockout of either stkP or ciaR gene of S. pneumoniae resulted in the decrease of ccn-microRNAs and presentation of drug resistance and complementary pairing among the seed sequences in ccn-microRNAs and pbps-mRNAs. Therefore, this research project would confirme that both ccn-microRNAs and Hfqs chaperonin compose complexes that combine with pbps-mRNAs to recruit RNA exonuclease for degradation of pbps-mRNAs or inhibit translation of pbps-mRNAs, StkP recognizes β-lactam antibiotics through its SXXK motif and both StkP and PhpP phosphotase compose a signal network for regulation of CiaR phosphorylation, and phosphorylated CiaR can combine with promotors of ccn-microRNAs, Hfqs and RNA exonuclease encoding genes to up-reguate their expression. All the experimental results in vitro will be further verified using target gene-knockout mutants-infected mice. The aim of this project is to illuminate the ccn-microRNAs-Hfqs mediating PBP mutation-independent drug resistance mechanism and their expression regulation network.

近年发现肺炎链球菌存在青霉素结合蛋白（PBP）突变非依赖耐药，其机制不明。文献报道StkP激酶和CiaR调节蛋白失活后产生PBP突变非依赖耐药，ccn-microRNAs基因可能是CiaR靶基因。我们前期研究发现stkP或ciaR基因敲除后ccn-microRNAs下降并出现耐药，其种子序列能与pbps-mRNAs互补配对。本项目拟确定ccn-microRNAs与Hfqs伴侣蛋白组成复合物并结合pbps-mRNAs后招募RNA外切酶使其降解或抑制翻译、StkP识别β-内酰胺类抗生素SXXK基序并与PhpP磷酸酶组成信号网络调控CiaR磷酸化、磷酸化CiaR与ccn-microRNAs和Hfqs及RNA外切酶基因启动子结合并上调其表达，再用靶基因敲除突变株感染小鼠验证体外实验结果，阐明ccn-microRNAs-Hfqs复合物介导PBP突变非依赖β-内酰胺类抗生素耐药机制及其表达调控网络。

近年肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药性及耐药率不断升高，明确耐药机制是控制耐药的关键。β-内酰胺类抗生素与细菌表面青霉素结合蛋白（PBPs）结合后发挥作用不进入菌体。PBPs作为转肽酶、内肽酶和羧肽酶参与革兰阳性菌肽聚糖合成，PBPs分子中有SXXK、SXNVP和KS/TG基序是β-内酰胺类抗生素结合的关键位置，PBPs分子基序变构导致β-内酰胺抗生素结合受阻，肽聚糖组装受阻导致细菌裂解达到杀菌目的。已有研究表明该菌不产β-内酰胺酶，PBPs基序突变导致耐药是目前被临床广泛研究的抗生素耐药机制，但PBPs基序突变不足以解释所有肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药。前期研究也发现转录调控因子CiaR通过下调pbp1a、pbp1b和pbp2b基因表达产生耐药，但pbp2a、pbp2x和pbp3基因如何参与β-内酰胺类抗生素耐药机制不明。近年发现，细菌等原核细胞也有多种microRNAs，伴侣蛋白Hfq可提高microRNA稳定性、与靶mRNA亲和力、增强核酸酶抗性或消除靶mRNAs 5’端二级结构。本项目采用Co-IP和ITC及Biacore、定量RT-PCR、EMSA和定位突变、抗体捕获靶蛋白磷酸化定量检测和靶基因敲除等方法。确定亚致死量β-内酰胺类抗生素可作为肺炎链球菌环境信号、激活StkP/PhpP信号偶联并经CiaR直接上调ccn-microRNAs与Hfqs伴侣蛋白及3’-RNA外切酶表达、ccn-microRNAs-Hfqs复合物招募3’-RNA外切酶降解pbps-mRNAs或阻断pbps-mRNAs翻译的肺炎链球菌PBPs突变非依赖耐药新机制。本项目主要科学意义：阐明ccn-microRNAs-Hfqs复合物介导肺炎链球菌PBPs突变非依赖β-内酰胺类抗生素耐药机制及其ccn-microRNAs、Hfqs和3’-EXO表达调控网络。研究成果已发表标注本项目资助论文7篇，其中SCI论文2篇；培养硕士生3名；项目主持人完成浙江省卫生高层次创新人才培养、作为承办单位完成了浙江省微生物学会2018年学术年会暨理事换届会并担任浙江省微生物学会理事和医学微生物学专委会副主任委员，参加了2019年11届国际钩端螺旋体学术会议；获得呼吸道细菌流感嗜血杆菌相关国家发明专利3项。综上所述，我们全面完成了本项目研究任务。