药物代谢酶绝对丰度快速测定方法的建立

临床联合用药发生的不良反应屡有报道，以细胞色素P450 酶(P450)为主的肝.脏药物代谢酶在其中发挥重要作用，药物代谢酶谱的寻找和相关调控是药理/毒理学领域的.一个研究热点和难点。药物代谢酶谱绝对浓度的快速测定是指基于多反应监测（Multi Reaction Monitor，MRM）与同位素标记肽段的靶向蛋白质组学技术，同时对多种肝脏药物代谢酶进行绝对浓度测定，建立其快速检测的平台。与传统的药代酶酶活测定、mRNA丰度测定及蛋白质丰度变化趋势测定（western blot）方法相比，该方法具有通量高、特异性强和准确度高的特点。在此基础上，我们将对健康成人肝脏中全部药物代谢酶的绝对浓度进行测定，不仅为用药前后药代酶在肝脏表达变化的测定提供参考数据，也为以药代酶为基础的药物相互作用机制研究奠定基础。

肝药酶浓度测定对于研究药物代谢、用药安全及药物间的相互作用具有十分重要的意义。因此，我们运用QconCAT结合MRM方法对人肝微粒体中的肝药酶进行高通量的精确定量。目前，药物对药代酶的检测方法仍多限于酶活性测定、mRNA丰度测定或者简单的蛋白质丰度变化趋势测定（免疫组化、western等），并非所有的药物代谢酶都有成熟的活性检测方法及相应的商业化抗体；mRNA丰度及蛋白质丰度又不完全一致。作为上述检测方法的补充，本研究旨在基于QconCAT/MRM技术建立26个肝药酶快速、高通量的检测方法。本研究为26个人肝脏表达的药物代谢酶提供可用于定量的肽段56条，每条肽段提供3对离子对信息。方法学评估结果表明各肽段在2-500 fmol丰度范围内的标准曲线回归系数r值均大于0.99。用3个不同浓度（8-80 fmol）的质控样本(quality control，QC)评估结果显示，定量精确度（1-RE）在91.5-98.67%， 准确度（1-RSD）在96.9%以内。用建立的方法分别测定50例混合及10例单例人肝微粒体中肝药酶的绝对丰度，丰度范围分别在2.83-161.66 、3.08-194.82 pmol/mg微粒体蛋白。两组样本中肝药酶的丰度变化趋势比较一致（r2=0.84），表明不同肝药酶在人群个体中的表达趋势比较一致。人肝脏中UGTs表达丰度明显高于CYP450s蛋白。丰度排前5位的是CYP2C9, UGT2B7, UGT1A4, UGT1A6 和UGT2B4，丰度分别是194.82, 184.73, 87.22, 71.40 and 58.47 pmol/mg 微粒体蛋白。本研究中，8个肝药酶UGT2B4, CYP27A1, CYP4F3, CYP4F2, CYP2J2, CYP4F12 UGT1A4 和CYP51A1首次在人群中给出绝对丰度信息。为了评估该方法与传统western方法测定丰度趋势的一致性，本研究以CYP3A4为例，比较该蛋白质在10例人肝微粒体样本中分别用两种方法测定的丰度变化的趋势，二者的一致率达0.87（r2=0.76）。总之，本研究建立了可信度较高的肝药酶绝对丰度快速、规模化测定方法，为26个肝药酶提供了在质谱水平可用于丰度测定的肽段和离子对。给出了其在小样本人群中的丰度参考值，为后续的药物代谢、药物相互作用及用药个体化研究提供技术支持。