中外猪品种4个候选基因的CNVs差异验证、边界鉴定及其在NF-кB通路中的免疫功能研究

We have identified lots of CNVRs (copy number variation regions) from the samples of both Chinese and foreign pig breeds based on 60K SNP array and next generation sequence data in our previous researches. In this project, we propose to chose four immune-associate genes (TLR9 、IL1R1、ZAP70和NLRX1) from those differential CNVRs between Chinese and foreign pig breeds occurred during domestication as our candidate genes to conduct studies as follows:.（1）To validate copy number of the candidate genes by qPCR and identify boundaries of these CNVs by long fragment amplification method..（2）To identify the function of these candidate genes. In order to evaluate their immune function, we plan to detect the activity of NF-кB signal by overexpress or knockdown the candidate genes in porcine macrophages..（3）To Investigate the effect of CNVs on candidate genes function. we are going to detect the functional alternation of candidate genes between two groups(CNV-positive and CNV-negative) . Utilizing the methods of (2), we will compare the function of these genes in vitro and in vivo..This project reveals the significance of the effect of large sequence variations on gene functions during domestication in Chinese and foreign pig breeds, and plays an crucial role in evaluating, conserving and utilizing Chinese local pig breeds.

申请者在前期研究中外品种基因组变异时发现大量拷贝数变异区域（CNVRs）。本项目以野猪到家猪驯化过程中在中西方品种存在差异的CNVRs中的4个免疫相关基因—TLR9 、IL1R1、ZAP70和NLRX1为候选基因，开展如下研究：（1）基因拷贝数变异的验证和CNV边界鉴定；（2）基因功能研究。以免疫细胞—猪巨噬细胞为材料，超表达或抑制表达候选基因，检测NF-кB调控通路活化与否来评价基因在免疫中的作用；（3）研究拷贝数变异对基因功能的影响。采用（2）中方法，在细胞水平和活体水平检测候选基因发生拷贝数变异后细胞中NF-кB下游通路的激活状况。综合上述结果分析候选基因及其拷贝数变异对NF-кB的调控作用。本项目对于揭示中外猪种在驯化过程中基因组中拷贝数变异的差异、拷贝数变异中大片段缺失、重复对基因功能产生的影响，对于发掘中国地方猪品种资源优势和保护利用具有重要意义。

在前期发现通城猪与大白猪对猪蓝耳病抗病性差异的基础上，进一步进行基因组和转录组测序，通过对课题组测序的10头通城猪、6头大白猪基因组数据和公共数据库下载的13头大白猪基因组数据（29个个体）进行全基因组CNV、InDel分析，结合6头通城猪和6头大白猪淋巴结、脾脏、睾丸转录组测序数据分别对以上结果进行验证，通过PCR和Sanger测序验证CNV和InDel进行验证，采用双荧光素酶报告实验对候选基因功能进行研究。主要研究结果如下：（1）通城猪中发现14857个CNV和406万个InDel，大白猪中发现11736个CNV和333万个InDel，仅6.90%CNV和0.12%InDel分布在外显子上；通城猪基因组中CNV和InDel数量均高于大白猪，且主要分布在非编码区；（2）173个CNV及3786个InDel在两品种中呈现极端分化，品种差异CNV和InDel所在基因主要富集在与生长发育、免疫、繁殖相关的通路上，且在X染色体60-80Mb区域上存在一段两品种完全分离的单倍型；（3）通过基因组水平的CNV分析，结合转录组测序数据对品种间变异进行验证，通过基因表达变化和基因功能富集分析，筛选了31个与免疫、生长发育、脂质代谢、繁殖相关的候选基因；（4）在基因组水平的InDel分析基础上，通过转录组数据分析InDel并对基因组数据进行验证，发现2049个位于外显子上的InDel在基因组和转录组中共存；（5）验证并准确鉴定16个候选基因上的CNV及其断点位置，并分别在通城猪和大白猪群体中检测与免疫（TRIM14、PRKCE、DCUN1D2、SPARCL1）、生长发育（AGXT2、CTNNA1）、繁殖（RAPGEF5、STRA8）及脂质代谢（PLEKHA2、SLCO1A2）相关基因的基因频率及基因型频率，基因频率和基因型频率在两品种存在差异；（6）鉴定了免疫相关候选基因DCUN1D2、SPARCL1基因组上的CNV导致其转录产物同一区域的片段缺失，其可能影响候选基因功能；（7）通过InDels的分析，筛选了与猪生长发育（GLI3）、叶酸受体FOLR2、免疫调节（ADAM17、PHLDA1）以及GTP酶（GSPT2）相关的候选基因，并在通城猪和大白猪群体进行了PCR验证及测序分型；（8）通过双荧光素酶报告实验验证了基因FOLR2在启动子区域的InDel影响该基因表达及启动子活性。