重要候选基因编辑文库筛选鉴定猪沙门氏菌抗性基因及其细胞与个体水平的功能验证

Pig Salmonella infection results in the huge economic losses in pig industry and also is a major threats to human food safety. Improvement of the resistance ability of the pig to the pathogenic bacteria genetically will be the useful strategy for healthy breeding and food safety . However, The genetic basis and the molecular mechanism of host (pig) immune response to the Salmonella infection is still remaining unknown. In our previous work, 1032 differentially expressed genes were screened from salmonella infected mesenteric lymph node by porcine genome microarray. Based on those 1032 genes, we will establish the lenti-virus mediated CRISPR/CAS9 gene knockout library. The bacteria resistance genes will be identified by functionally screening the library by the challenge of Salmonella with IPEC-J2 cells. Further, we will study the involved signaling pathways and molecular machinimas. The genetic modified pig will be generated to confirm the gene functions in vivo and evaluated for the possibility of application in pig breeding. These studies will not only expand the elucidation of the host response to Salmonella interaction, but also provide the valuable genetic material for pig disease resistance breeding.

猪沙门氏菌感染对养猪业及人类的食品安全都造成了很大的危害，从遗传本质上提高猪对病原菌的抗性是实现猪健康养殖和保证人类食品安全的有效手段。猪在沙门氏菌感染后机体免疫应答的遗传基础与分子机制至今尚未明确。申请者在前期的工作中，利用全基因组芯片在猪肠系膜淋巴结中筛选到了1032个与沙门氏菌感染密切相关的差异表达基因。在此基础上，申请者拟利用基因组编辑技术，建立慢病毒介导的1032个差异表达基因的CRISPR/Cas9敲除文库，在猪空肠上皮细胞中用沙门氏菌感染来筛选该文库，以精确鉴定猪的沙门氏菌抗性基因。进一步，在细胞水平解析其参与的信号通路与抗菌的分子机制，制备遗传修饰猪并分析其沙门氏菌感染后的表型，探讨该基因在猪抗病育种中应用的可能。本项目将不仅为高通量研究家畜功能基因提供新思路，而且将加深对宿主细胞在沙门氏菌侵染后分子机制的了解，也为猪的抗病育种提供基因素材与实践指导。

沙门氏菌感染对养猪业造成了极大危害，而屠宰过程中与猪肉的交叉污染也严重威胁到了人类的食品安全，从遗传本质上提高猪对病原菌的抗性是实现猪健康养殖和保证食品安全的有效手段。与猪沙门氏菌感染后肠系膜淋巴结的关键应答基因和通路不明确。本项目利用公共数据库筛选了沙门氏菌急性感染猪后猪肠系膜淋巴结的应答基因；建立了沙门氏菌来源的LPS的体外感染系统，并筛选出高表达CAS9的IPEC-J2细胞克隆；揭示了PPAR信号通路参与猪肠系膜淋巴结对沙门氏菌感染的应答，并发现脂代谢转录因子PPARγ在沙门氏菌感染后的猪肠细胞中显著上调，这些数据均表明宿主肠系膜淋巴结中脂代谢与免疫应答的密切关系；进一步，本项目阐释了抗沙门氏菌候选基因ATP7A，免疫相关基因RNF20及脂代谢相关基因SCD等在脂肪沉积中的关键作用；这三个基因在脂肪细胞中敲除后在脂肪中敲除之后，均能够显著降低脂肪细胞的分化效率，降低动物的脂肪沉积。此外，本项目在猪体细胞基因编辑技术的优化和应用方面也取得了进展。本项目成功构建出hA3A-BE3-NG载体，并在猪成纤维细胞中利用该载体对APN、CD163、MSTN和MC4R四个不同经济性状关联基因靶点进行同时编辑，筛选到四基因同时突变的单克隆细胞系，表明hA3A-BE3-NG具有更为宽松的PAM限制，有效拓宽了碱基编辑器在猪基因组中的可编辑区域。本项目揭示了脂代谢参与了猪肠系膜淋巴结对沙门氏菌感染的应答，为脂肪代谢与免疫应答的互作提供了新的数据。所鉴定出的免疫、脂肪沉积相关的基因不仅丰富了猪的功能基因组学，也为猪的分子设计育种提供了候选靶点。