TBX6相关先天性脊柱侧凸基因组重复拷贝数变异的隐蔽结构及潜在突变机制研究

Congenital scoliosis（CS）refers to the three-dimensional spinal deformity, resulting from the abnormalities of development of spine during embryonic period, with a significant genetic predisposition. Our previous studies first revealed that TBX6 null variants and a TBX6 common hypomorphic allele may contribute to CS with a compound inheritance model, thus we hypothesis that 16p11.2 / TBX6 deletion plays an important role in the genetic etiology of CS, thereby proposed the new concept of TBX6 relevant CS, firstly published in the "N Engl J Med". We propose a new hypothesis that recurrent copy number variation (CNV) potential structure and mutation may lead to the TBX6 relevant CS. We tried to carry out some deep researches: (1) Sanger sequencing TBX6 coding region, intron / exon junction region on a three-generations TBX6-CS family; (2) High-throughput sequencing to determine the presence of TBX6 CNV; (3) Predictive software detect breaking point to determine the breaking point and fine tune the position of the breaking point, to find out small variations around it. (4) Introduce gene sequence fragments and single nucleotide mutations in the vicinity of TBX6 / CNV breakpoint, to explore the CNV formation mechanism in TBX6 relevant CS patients. The results will provide a possible double-strand break-repair genetic model for CS. The model may provide a significant evidence to elaborate the genetic basis of CS, a precise description of CNV complex structures for the TBX6 gene, and an important meaning for early screening, clinical genetic diagnosis of CS.

先天性脊柱侧凸(CS)是指胚胎期脊柱发育异常导致的脊柱畸形，具有明显遗传倾向。课题组前期研究中首次发现16p11.2/TBX6缺失可能是CS重要遗传病因学基础，提出TBX6相关CS这一新概念，在《N Engl J Med》上发表，其突变机制尚不清。课题组以此为基础，提出“重复拷贝数变异（CNV）的隐蔽结构及潜在突变可能是导致TBX6相关CS重要机制”，拟进行深度研究：(1)三代TBX6-CS家系TBX6全长测序；(2)运用高通量测序确定TBX6存在CNV；(3)使用软件预测断裂点、确定断裂点和微调断裂点位置，找出其周围微小变异；(4)在TBX6/CNV断裂点附近插入序列片段及单核苷酸突变基因，探索突变机制。研究结果将为CS提供用于修复双链断裂复制可能的遗传学模式，为阐明CNV导致CS发病的遗传学基础、精确描述TBX6重复CNV的复杂结构提供证据，对CS的早期筛查、基因诊断等具有重要意义。

先天性脊柱侧凸(CS)是指胚胎期脊柱发育异常导致的脊柱畸形，具有明显遗传倾向。项目组在前期工作中首次在CS患者中重要发现 TBX6基因需要联合TBX6亚效等位基因来共同致病，提出16p 11.2/TBX6缺失是散发CS的重要遗传学病因基础。然而，全基因组CNV研究仅揭开了CS遗传学研究的序幕，尽管研究表明其致病机制与表型均符合TBX6相关CS，但其相关机制仍不清。因此课题组拟对其他CNV隐蔽结构进行深度研究。.按照项目的研究计划，首先以中国汉族人群TBX6相关CS患者为研究对象，针对性地分析了CS伴发其他畸形的临床分布特点并探讨各系统畸形之间可能的内在联系。在回顾性分析的213例患者中，31.9%合并椎管内畸形，以脊髓纵裂最常见，分节不良型CS患者合并椎管内畸形发生率明显高于形成障碍型(P=0.01)和混合型(P=0.01)。此外，课题组纳入了来自多中心多单位的独立CS疾病队列，通过外显子测序、Sanger测序及通过对患者完整的临床资料及影像学资料进行评估,证实TBX6位点的非同义突变可通过杂合突变的形式导致复合突变，结合临床特征分析，通过“基因型-表型”关联研究分析提出了全新的先天性侧凸亚型（TBX6-associated congenital scoliosis，TACS）。TACS共同的临床特点为：具有一个或多个半椎体或蝴蝶椎，以胸腰椎畸形更为普遍，课题组同时通过Crispr/cas9技术首次建立的tbx6基因复合杂合变异的小鼠模型，并发现小鼠中椎骨发育不全比例达到69.23%且大多数为胸腰段畸形。由此，我们得到了具有TBX6基因变异的中国人群、日本人群以及基因敲除小鼠的高度一致性表型，相关研究成果发表在《Genet Med》杂志。.课题组在患者队列中进一步验证16p 11.2 BP4-5重复突变导致的TBX6剂量改变对表型的影响，并在小鼠模型中通过基因编辑改变TBX6基因表达水平对致病性进行验证，通过双荧光素酶报告基因实验验证了TBX6表达水平升高，提出及证实16p 11.2/TBX6相关CS可能是由于DNA双链断裂后由基因组远处的核苷酸模板序列插入修复导致的人类遗传病，TBX6剂量升高可以显著增加先天性脊椎畸形的风险，相关研究成果发表在《J Med Genet》杂志。