基于单细胞RNA测序解析鸡肌内脂肪特异性调控分子机理

As an important factor influencing meat quality in chicken, promoting intramuscular fat (IMF) deposition is one of major goals in breed cultivation. Because chicken IMF tissue could not be separated from muscle, previous studies focus on analysis of the whole muscle (IMF included). However, the roles of genes, regulatory factors and how are they regulated IMF deposition are not clear yet. Single cell manipulation and amplification techniques bring sequencing technology to the single-cell level. In this proposal, single-cell transcriptomics will be used in selected chicken line with high IMF content and its control groups. Firstly, single IMF cells will be sorting with Pasteur pipette under the microscope and harvest pure IMF cells for single-cell RNA sequencing. Secondly, differentially expressed mRNA and long non-coding RNA (lncRNA) will be identified and molecular regulatory network will be constructed. Thirdly, the function of genes in molecular network cores will be validated in vitro and in vivo with gene overexpression and knockdown methods. Lastly, correlated lncRNAs will be examined deeply in terms of their regulatory roles in genes expression and the regulatory mechanisms in IMF deposition. In summary, key genes and lncRNAs in tissue-specific manners and those regulatory mechanisms in IMF deposition will be elucidated. Molecular basis for culturing new high-quality breeds will be laid.

肌内脂肪（IMF）是影响肉品质的重要因素，也是培育优质肉鸡品系的主要目标性状之一。由于鸡IMF组织无法被分离，已有研究均以肌肉组织整体（含IMF）进行检测，对IMF组织特异性基因及分子调控机理还不清楚。单细胞测序技术能够实现超微量样本在全基因组水平的精确测定，因此本项目引入单细胞RNA测序技术，以特有的京星黄鸡高IMF品系及其对照系为素材，在显微操作分离单细胞基础上，获得高纯度IMF细胞进行转录组测序；基于差异表达mRNA和长链非编码RNA（lncRNA）构建出IMF相关分子网络；在细胞和成体水平过表达和敲减重要节点基因和相关lncRNA，验证其对细胞、组织发育及相关基因表达的作用，预期结果将鉴定出特异性调控IMF沉积的关键基因，明确lncRNA通过靶向调控关键基因进而影响IMF沉积的分子机理，为优良鸡种分子育种提供理论基础。

肌内脂肪（IMF）是影响肉品质的重要因素，也是培育优质肉鸡品系的主要目标性状。针对鸡IMF组织特异性基因及分子调控机理不清楚这一问题，本项目以生长早期5日龄（D5）和生长快速期100日龄（D100）的京星黄鸡IMF上选系为素材，分别提取胸肌组织原代肌细胞和IMF细胞，进行10×Genomics单细胞RNA测序。测序结果基于基因表达相似性进行分群，鉴定到D5胸肌组织共有10个细胞亚群，D100共有7个细胞亚群。D5胸肌组织中，亚群0、1、3、5、6为成肌细胞群，2和8两个亚群为脂肪细胞亚群。而在D100组织中，仅鉴定到一个肌细胞群和一个脂肪细胞群。比较分析两发育阶段成肌细胞群和脂肪细胞群，发现了肌细胞的Myf5，NRXN1，RASD1和FGFR4等与肌肉组织发育等生物学过程相关的基因，可作为成肌细胞的标记候选基因，IMF细胞中APOA1和COL1A1等19个基因与IMF的代谢和转运等生物学过程有关，可作为IMF细胞的标记候选基因。结合候选基因时空表达模式检测，分别以5日龄和66日龄京星黄鸡和42日龄白羽肉鸡胸肌组织为试验材料，利用RNA原位杂交技术验证已知脂肪标志基因ADIPOQ与新基因APOA1和COL1A1基因在组织中的表达水平和空间异质性，结果表明这三个基因在胸肌组织中的细胞外基质和细胞膜表达，且存在大量共定位，同时APOA1和COL1A1分别在白羽肉鸡和黄羽肉鸡两个高低IMF差异表型组中，均差异表达显著，确定了APOA1和COL1A1可作为鸡IMF相关的特异性新的分子标记。此外，通过系统的转录组学分析，获得与IMF沉积相关的lncRNA ENSGALG00000041996，可能通过调控脂肪酸受体CD36和长链酰基辅酶A脱氢酶ACADL发挥对IMF的调节作用。综上，本研究首次研究报道了不同发育阶段鸡肌肉细胞和IMF细胞的细胞组成，丰富了鸡骨骼肌的异质性信息，获得了标志性基因和关键lncRNA，为IMF分子调控机制解析提供重要基础。