红花赖氨酸生物合成关键酶基因AK和DHPS的分离，表达分析及其作用机制研究

It is a worldwide problem of poor nutritional quality in crop seeds. Lysine is a nutritionally important essential amino acid,that is not synthesized by human and its monogastric livestock and should be supplemented in their diets. It is a new crops that is used medicine,fuel and feed for safflower,and feeding nutritional value is mainly lysine level in the asparate-pathway in safflower seed. However, because its level is most limiting in safflower seed.Metabolic engineering approaches led to significant increase in Lysine level in seeds by enhancing its synthesis. Therefore, finding the mechanism of lysine biosynthsis in safflower seed is urgently need.In this project,we found several genes, especially aspartate kinase (AK) and dihydrodipicolinate synthase (DHPS) through high throughput Illumina sequencing and gene expression profiles.Based on these,we are to be analysis the express profiles of AK and DHPS in different developmental stages of safflower seed;in the meanwhile, we are to be analysis lysine content by HPLC in different developmental stages of safflower seed,and found out the relationship of the express AK and DHPS gene and lysine content;On this basis, we would use overexpress and RNAi strategy and functional complementation tests of Arabidopsis mutants further research biological function of two key enzymes.All of these will provide a new opportunity molecular mechanism of lysine synthesis in safflower seed.On the other hand,this study will provide new method for molecular breeding to cultivate high level lysine in safflower seed.

农作物种子营养品质低下是一个世界性问题。赖氨酸是一种非常重要的营养物质，其含量高低是衡量农作物种子营养品质的关键因素之一。红花是一种集药材、油料和饲料为一身的新型经济作物。红花籽粕饲用营养价值主要体现在以天冬氨酸为前体的赖氨酸等必需氨基酸含量上。然而，在红花种子中赖氨酸含量极低，是主要限制性氨基酸。因此，提高红花种子赖氨酸含量显得尤为重要。本项目拟在通过转录组测序和表达谱分析鉴定红花种子赖氨酸生物合成途径关键酶基因，即天冬氨酸激酶CtAK和二氢吡啶二羧酸合酶CtDHPS基因基础上，利用基因克隆技术获得上述基因的全长cDNA片段；并深入研究它们在红花种子不同发育时期的表达情况及其与赖氨酸含量的关系；在此基础上，通过超表达和RNAi技术以及拟南芥突变体回补试验进一步研究这两个基因的生物学功能，揭示它们在红花种子赖氨酸生物合成分子机制中的作用，为利用分子育种技术培育高赖氨酸红花新品系提供新思路。

红花（Carthamus tinctorius L.）是菊科红花属双子叶植物，是一种集药材、油料、饲料为一身的新型经济作物。在我国，对红花种子的油脂及花冠的色素已经进行了广泛深入的研究，而对红花饲用价值的基础研究极少见报道。红花种子饲用的营养价值一方面体现在丰富的蛋白质上；另一方面则主要体现在以天冬氨酸为前体的赖氨酸等必需氨基酸含量上。但是，目前有关红花CtAK和CtDHPS基因在红花种子赖氨酸合成途径中的作用机制研究国内外尚未见报道。本项目承担了红花籽粒赖氨酸生物合成关键酶AK和DHPS基因的分离、表达分析及其调控机制的研究工作，通过研究得到如下结果：.利用RT-PCR和RACE技术成功克隆红花CtAK1和CtDHPS基因并进行序列分析。发现红花CtAK1和CtDHPS氨基酸序列的同源性和保守结构域均属天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶基因家族，可能具有类似的生物学功能。通过qRT-PCR技术筛选得到红花种子不同发育时期稳定表达的内参基因组合CtEF1A和Ct60S，以此内参组合为参考，分析CtAK1和CtDHPS基因在红花籽粒不同发育时期的表达模式，结果显示：CtAK1和CtDHPS基因在红花籽粒整个发育时期呈现先升高后下降，继而迅速升高而后又下降的趋势，这与种子的生理发育表现一致；同时分析了红花籽粒发育后期赖氨酸的含量与基因表达量的相关性，结果表明：红花籽粒发育后期赖氨酸的积累规律与CtAK1和CtDHPS基因的表达变化趋势基本一致，证明CtAK1和CtDHPS基因的表达与红花籽粒赖氨酸的合成存在紧密的调控关系。利用DNA重组技术成功构建红花CtAK及其突变体和CtDHPS基因的超表达载体和RNAi载体，通过冻融法转化农杆菌LBA4404，经PCR鉴定获得它们的农杆菌工程菌。通过转基因功能分析，异源和同源超表达红花CtAK和CtDHPS基因均表现出代谢产物含量有所提高的表型，超表达拟南芥突变体回补实验表明CtAK和CtDHPS基因的表达在一定程度可以回复拟南芥的表型功能。.通过以上结果，初步揭示红花CtAK和CtDHPS基因的生物学功能及调控红花赖氨酸生物合成的分子机理，为通过分子育种技术培育高赖氨酸含量的红花新品系提供重要的基因资源和科学依据。