m6A mRNA 甲基化修饰在免疫应激诱导仔猪肝脏损伤中的作用及营养调控

Immunological stress, a common issue in pig production, can cause liver damage, decrease growth performance, and even death, however, its epigenetic mechanisms are not clear. Using weaning piglets and immunological stress induced by LPS injection as a model, this project will investigate the levels of m6A RNA methylation, m6A-related genes and signal pathways in weaning piglets challenged with LPS. The profile of m6A RNA methylation in the liver of piglets will be determined using MeRIP-Seq, and target genes and signal pathway will be further explored. The transcriptional and post-transcriptional regulation of m6A and the biological functions of m6A RNA methylation on the liver damage induced by LPS injection will be investigated by knock down or over-expression of m6A methyltransferase METTL3 in vitro. In addition, the signaling pathways of LPS-induced m6A RNA methylation change will be explored by knock down or over-expression of HIF1-a or MAT2A in hepatic cells or Kupffer cells isolated from the liver of piglets in vitro. Finally, the epigenetic regulatory factor resveratrol will be used as the nutritional regulator to investigate the effect of resveratrol on the protection of liver from damage and its epigenetic mechanism, and the new direction in nutritional regulation of piglets will be established to offer a framework for the growth and development of weaning piglets.

免疫应激在养猪生产中普遍存在，可造成肝脏损伤，引起猪生长抑制，甚至死亡，但其表观遗传学机制尚未清楚。本项目以断奶仔猪和LPS诱导免疫应激作为模型，分析肝脏N6-甲基腺嘌呤（m6A）RNA甲基化水平及相关基因和信号通路的变化；采用MeRIP-Seq获取仔猪肝脏m6A mRNA 甲基化图谱，揭示m6A修饰的基本特征，获取靶基因和信号通路，并通过体外将m6A的甲基化转移酶METTL3敲低或过表达，揭示m6A对靶基因转录和翻译的调控，阐明m6A在免疫应激诱导肝脏损伤中的分子生物学功能；其次，在体外分离培养仔猪肝细胞和Kupffer细胞，将HIF1-a和MAT2A基因敲低或过表达，探讨LPS诱导肝脏m6A RNA 甲基化变化的信号途径；最后，采用表观因子白藜芦醇作为营养调控物，探讨其对仔猪肝脏损伤的保护作用及其介导m6A的表观遗传学机制，从而确定新的营养调控靶点，为仔猪生长发育调控新技术提供理论依据

在我国养猪生产中，饲养环境中的细菌、病毒、内毒素等病原体或非病原体常常引起猪的免疫应激，造成肝脏的损伤。但是，对于免疫应激诱导肝脏损伤的分子生物学机制尚未完全清楚，特别是在RNA表观遗传学方面。白藜芦醇作为一种植物多酚和重要的表观因子，在保护人类肝脏健康方面发挥重要作用，然而，其在畜禽上的研究仍十分缺乏，其深层机理尚未清楚。本试验通过LPS建立免疫应激模型，研究m6A RNA甲基化在免疫应激诱导断奶仔猪肝脏损伤中的作用，探讨白藜芦醇缓解断奶仔猪免疫应激的m6A RNA甲基化机制。研究表明，LPS可激活肝脏NOD1/NF-κB信号通路，显著提高肝脏中总的m6A RNA甲基化水平，促进巨噬细胞向M1炎症性极化，上调炎症细胞因子水平，激活先天免疫应答，诱导肝脏损伤。MeRIP-seq测序鉴定到了合计5014个m6A修饰峰，构建了m6A修饰图谱及其修饰特征，同时发现LPS显著改变NOD1、RIPK2、NFKBIA等mRNA上的m6A修饰丰度。在肝细胞和巨噬细胞中，敲低甲基转移酶METTL3显著上调NOD1/NF-κB信号通路相关基因的表达，表明m6A能够调节NOD1/NF-κB信号通路，决定巨噬细胞的极化命运。以上结果表明LPS可通过m6A在转录后水平调控炎症相关基因的表达，激活NOD1/NF-κB信号通路，促进炎症的发生，损伤肝脏。另外，LPS注射可增加肝脏中ROS水平，激活低氧诱导因子HIF-1α，提高甲硫氨酸腺苷转移酶2A (MAT2A)的水平，从而提高肝脏总的m6A水平，表明ROS/HIF-1a/ MAT2A是LPS改变m6A修饰的关键分子途径。在营养调控方面，白藜芦醇可减少仔猪肝脏巨噬细胞的M1型极化，减少炎症细胞因子的分泌，从而减轻肝脏损伤。在分子机制上，白藜芦醇通过降低仔猪肝脏中ROS水平，下调HIF-1α表达，减少MAT2A水平，从而降低肝脏m6A甲基化修饰，最终抑制NOD1/NF-κB信号通路的激活，从而减少炎症发生，缓解仔猪肝脏损伤。该项目揭示了LPS激活仔猪肝脏先天免疫应答的m6A RNA甲基化分子途径， 阐明了白藜芦醇基于m6A RNA甲基化调控断奶仔猪免疫功能的分子生物学机制，为仔猪生产提供新的基础理论支撑和营养调控方式。