负载多重活性信号的天然多糖支架在肝组织工程中的应用

In order to resolve the problems in hepatocyte tissue engineering, such as the low density of vessels and poor survival of liver cells, we intend to modifiy glycyrrhetinic acid and bioactive peptide (REDV) onto the natural polysaccharides, such as alginate and chitosan, to develop a bioactive extra cellular matrix materials which is suitable for the proliferation of endothelial cells and hepatocyte. Meanwhile, we will prepare porous ECM scaffolds using ion- or enzyme-crosslinking method, and evaluate the effect of the chemical structure of scaffolds on angiogenesis and the formation of liver tissue in vivo. Besides, we will introduce different growth factors to the ECM scaffolds both by physical adsorption and covalent immobilization to achieve a dual growth factor loaded scaffolds, which can control the effective sequence and time of the growth factors. The regulation of chemical properties and physical structures to the entrapment and release of growth factors will also be investigated. Furthermore, we will study the influence of covalent immobilization method to the activity of the growth factors immobilized, and investigate the promotion of the synergistic effect of the dual growth factors on the formation of vessel network and the generation of liver tissue. This work has the potential to provide theory proof and experimental basis for the clinic application of hepatocyte transplantation.

为了解决肝组织工程中存在的血管密度不足、肝细胞存活率低下等问题，本课题拟以海藻酸盐、壳聚糖等天然多糖为基质材料，在材料上固定甘草次酸及活性多肽REDV，制备同时适合内皮细胞增殖及肝细胞生长的活性细胞外基质材料；通过离子交联或酶交联法制备多孔ECM支架，评价其对体内血管新生及肝组织形成的影响。同时，利用物理吸附及共价修饰的方法分别在支架材料中负载不同生长因子，实现双重生长因子程序化协同起效；在此基础上考察支架材料化学性质、物理结构等因素对生长因子包埋、释放行为的调控效果；研究共价固定技术对固定化生长因子活性的影响；并考察双重生长因子间的协同作用对血管网络形成及肝组织新生的促进作用，为肝细胞移植技术早日走向临床提供一定的理论依据和实验基础。

为了解决肝组织工程中存在的血管密度不足、肝细胞存活率低下等问题，本课题拟以海藻酸盐、壳聚糖等天然多糖为基质材料，在材料上固定甘草次酸（GA）及活性多肽REDV，制备适宜内皮细胞增殖及肝细胞生长的活性细胞外基质材料；通过离子交联或酶交联法制备多孔ECM支架，评价其对体内外血管新生及肝组织形成的影响。实验结果表明：修饰REDV的海藻酸钠材料较其他黏附性多肽修饰材料具有更好的内皮细胞选择性黏附能力和促进内皮细胞增殖的能力；体内实验进一步表明REDV修饰材料具有更好的微血管形成诱导功能。在此基础上，我们以纳米金为内核，制备了多价化REDV配体簇，并将其固定到海藻酸钠水凝胶中。相对单价化配体，该多价化配体簇具有更好的内皮细胞亲和能力以及微血管诱导功能。而GA的引入可显著提高材料的肝细胞亲和性，不仅可促进肝细胞的粘附、增殖，还可在三维培养中促进多细胞聚集体的形成，进而保持正常肝细胞的生理功能。进而我们将GA修饰海藻酸钠作为细胞交联剂用于三维肝细胞球的制备，通过将此聚合物与肝细胞简单的共混培养即可获得直径在200 μm的肝细胞球，该方法简便、绿色，无需复杂设备及化学修饰，有望解决目前肝细胞球制备困难的问题。. 此外，针对组织工程中血管网络形成及肝组织重建的时效性差别，本研究利用物理吸附负载了促血管生产的VEGF，同时用共价修饰的方法在支架材料中引入促进肝组织生长的HGF，实现双重生长因子程序化起效。结果显示：该支架材料可实现对VEGF的快速大量释放，促进支架中血管网络的形成。而共价修饰的HGF则可在支架内长期起效，体外实验表明该支架中种植的肝细胞可更好地形成三维聚集体，并具有更好的白蛋白及尿素的合成能力。后续研究中，我们将进一步探索大规模血管网络的快速构建方法，为肝组织工程技术早日走向临床提供一定的理论依据和实验基础。