以病人iPSC来源的血清素神经元为模型研究TPH2基因突变在抑郁症中的作用机制

Tryptophan hydroxylase-2 (TPH2) gene is uniquely expressed in serotonin neurons in the brain. Its mutations are closely associated with major depressive disorder (MDD). However, because of lack of studies on patients’ serotonin neurons, the effects of TPH2 mutations on MDD-serotonin neurons are still unknown. Recently, we have demonstrated that by accurately modulating signaling pathways, serotonin neurons were efficiently differentiated from human induced pluripotent stem cell (iPSC). This provides us a very useful tool to study the effects of TPH2 mutations on MDD-serotonin neurons. In this study, we will firstly generate iPSC from MDD patients with TPH2 mutations, and differentiate them into serotonin neurons. Pathological phenotypes will be determined by assessing the morphology, electrophysiology, neurotransmitter releasing and transplantation of MDD iPSC-derived serotonin neurons. Then, TPH2 will be mutated in healthy serotonin neurons and corrected in MDD-serotonin neurons by gene-editing via CRISPR/Cas9. Phenotypical changes between before and after gene-editing will help confirm the effects of TPH2 mutations on MDD-serotonin neurons, which will help us uncover the mechanism of TPH2 mutations in the development of MDD and provide a new strategy to diagnose and treat MDD.

大脑TPH2基因仅在血清素神经元中表达，其突变与抑郁症的发生密切相关；然而，该基因突变对抑郁症病人血清素神经元的影响尚无报道，其在抑郁症发病中的作用机制尚不明确。申请人近期研究表明：通过精确调控信号通路，可以高效定向分化人类诱导性多能干细胞为血清素神经元，这为研究抑郁症提供了重要的细胞模型。在此基础上，本项目将通过重编程技术获得携带有TPH2基因突变的抑郁症患者的诱导性多能干细胞，并定向分化为血清素神经元，通过检测细胞形态、神经电生理、神经递质释放、体内移植等方法发现疾病表型；再通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术，突变健康血清素神经元的正常TPH2基因，及纠正抑郁症血清素神经元突变的TPH2基因，通过观察基因编辑前后血清素神经元的表型变化，明确TPH2基因突变是否是引起抑郁症血清素神经元异常表型的主要因素，进而阐明TPH2基因突变在抑郁症发病中的作用机制，为抑郁症的诊疗提供新策略。

大脑TPH2基因仅在血清素神经元中表达。临床关联性研究显示TPH2突变与抑郁症的发生密切相关；然而，该基因突变对人类血清素神经元的影响尚无报道，其在抑郁症发病中的作用机制尚不明确。申请人的前期研究表明：通过精确调控信号通路，可以定向分化人类多能干细胞为血清素神经元，这为研究抑郁症提供了重要的细胞模型。在此基础上，本项目先通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，将野生型人类胚胎干细胞H9中的TPH2基因突变，并在此突变细胞系的基础上构建出TPH2-EGFP报告细胞系，经定向分化为血清素神经元后，生成的血清素神经元能够特异性地表达绿色荧光蛋白EGFP，有利于精准比较突变和野生型血清素神经元的各项表型：标志物的表达、神经元的形态、神经递质的合成分泌、体内外电生理、转录组差异分析等。研究发现，①TPH2-EGFP报告细胞来源的血清素神经元绿色荧光蛋白与TPH2很好地共表达，且不影响血清素神经元的命运决定，这为活细胞状态下监测血清素神经元以及纯化血清素神经元用于组学研究提供了重要工具；②点突变的血清素神经前体及神经元表达的特异性标志物无明显差异，提示点突变对血清素神经元的发育影响不明显；③点突变的血清素神经元的形态无明显差异，提示点突变对血清素神经元的形态影响不明显；④点突变的血清素神经元血清素合成降低，5-HTP短时处理可以逆转其血清素水平，提示针对该点突变的病人，可通过给予5-HTP改善脑内血清素缺乏的现象，为此类抑郁症患者的临床精准治疗提供用药参考；⑤点突变导致血清素神经元神经电生理功能异常，可能会影响神经环路的形成，进而导致该类抑郁症患者易感甚至发病。